王曉飄 肖學(xué)成

[摘要]目的 通過(guò)高效液相色譜建立酮洛芬凝膠中有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法。方法 采用色譜柱ZORBAX SB-Phenyl（4.6 mm×250 mm，5 μm），以0.15%三氟乙酸乙腈溶液為流動(dòng)相A，以0.15%三氟乙酸溶液為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm， 流速為1.3 ml/min;柱溫為30℃。結(jié)果 在所建立的色譜條件下，酮洛芬與各雜質(zhì)分離度良好，酮洛芬凝膠溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定，各雜質(zhì)及主峰的RSD均<2%。結(jié)論 本法專屬性好，可以有效分離各主成分及有關(guān)物質(zhì)，可以準(zhǔn)確測(cè)定酮洛芬凝膠中酮洛芬的有關(guān)物質(zhì)。

[關(guān)鍵詞]酮洛芬凝膠;酮洛芬;高效液相色譜法;有關(guān)物質(zhì)

[中圖分類號(hào)] R917? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1674-4721（2019）2（b）-0008-04

酮洛芬的化學(xué)名為3-苯甲?；?α-甲基苯乙酸，是一種優(yōu)良的2-芳基丙酸類非甾體抗炎鎮(zhèn)痛藥[1]。其作用機(jī)制主要是通過(guò)抑制體內(nèi)環(huán)氧合酶（COXs）、脂氧化酶（LOXs）的生物活性，從而抑制致炎物質(zhì)前列腺素（PGs）、白三烯（LTs） 的合成，酮洛芬還具有對(duì)抗緩激肽釋放、清除羥自由基以及穩(wěn)定溶酶體膜活性，產(chǎn)生良好的解熱、鎮(zhèn)痛和抗炎作用[2]。臨床研究表明[3]，酮洛芬是治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病的首選藥物[4]，國(guó)外還用于治療牙痛、術(shù)后疼痛、癌性疼痛和紅斑狼瘡、支氣管炎等疾病[5]，對(duì)于軟組織受傷的治療效果也非常好[6]。

酮洛芬凝膠是酮洛芬的新型載體-傳遞體（transfersome）凝膠制劑，主要用于骨性關(guān)節(jié)炎、肩關(guān)節(jié)周圍炎、肌腱炎等疾病的鎮(zhèn)痛治療[7]。傳遞體載體能用于靶向用藥部位之下的肌肉和關(guān)節(jié)，因?yàn)樗鼈儾粫?huì)被局部的皮下微循環(huán)所清除[8]，可提高局部藥物濃度，增強(qiáng)藥效[9]。近年來(lái)對(duì)酮洛芬凝膠進(jìn)行研究，為抑制軟組織損傷相關(guān)性疼痛提供了一種有前途的方法[10]。

1材料與方法

1.1儀器

UltiMate 3000 高效液相色譜儀（美國(guó)戴安）;AUW 220D電子分析天平（日本島津）;ZORBAX SB-Phenyl（4.6 mm×250 mm，5 μm）;CSH-1000 GSD-1型綜合藥品穩(wěn)定性試驗(yàn)箱（重慶創(chuàng)測(cè)科技有限公司）。

1.2藥物與試劑

酮洛芬凝膠（武漢諾安藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20170401、 20170402、20170403）;市售酮洛芬凝膠（A.Menarini Industrie Farmaceutiche Riunite S.r.l.，批號(hào)：269、270;商品名：法斯通凝膠）;酮洛芬對(duì)照品（由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，批號(hào)：100337-201104）;酮洛芬雜質(zhì)A對(duì)照品（由歐洲藥典委員會(huì)提供，批號(hào)：00IFG7、00H5N6）;酮洛芬雜質(zhì)B對(duì)照品（由Cato Research Chemicals Inc提供，批號(hào)：C4X-14712-1407）;酮洛芬雜質(zhì)C對(duì)照品（由歐洲藥典委員會(huì)提供，批號(hào)：0022rJ、0022tD）;酮洛芬雜質(zhì)D對(duì)照品（由Cato Research Chemicals Inc提供，批號(hào)：C4X-14714-1505）;酮洛芬雜質(zhì)E對(duì)照品（由Cato Research Chemicals Inc提供，批號(hào)：C4X-14715-1504）;酮洛芬雜質(zhì)F對(duì)照品（由Cato Research Chemicals Inc提供，批號(hào)：C4X-14716-1309）;酮洛芬乙酯對(duì)照品（由Cato Research Chemicals Inc提供，批號(hào)：C4X-147111-1507）。

乙腈（色譜純，Merck）;三氟乙酸（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）;氯化鈉（臺(tái)山市新寧制藥有限公司）。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

采用ZORBAX SB-Phenyl（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，以0.15%三氟乙酸-乙腈溶液為流動(dòng)相A，以0.15%三氟乙酸溶液為流動(dòng)相B，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)為254 nm，柱溫設(shè)為30℃，流速為1.3 ml/min，進(jìn)樣量20 μl，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

2.2溶液的配置

2.2.1供試品溶液? 取酮洛芬凝膠約1 g，精密稱定，置25 ml量瓶中，加0.15%三氟乙酸-乙腈溶液-0.15%三氟乙酸溶液（20∶80）（以下稱稀釋劑）20 ml和氯化鈉2 g，振搖，使氯化鈉溶解，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液（1 mg/ml）。

2.2.2原料供試品溶液? 取酮洛芬原料藥20 mg，精密稱定，置20 ml量瓶中，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3空白輔料溶液? 取不含酮洛芬的空白凝膠約1 g，精密稱定，置25 ml量瓶中，加稀釋劑約20 ml和氯化鈉2 g，振搖，使氯化鈉溶解，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液作為空白輔料溶液。

2.2.4對(duì)照品溶液? 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下的供試品溶液適量，加稀釋劑定量稀釋成濃度約為2 μg/ml的對(duì)照品溶液。

2.2.5系統(tǒng)適用性溶液? 取酮洛芬原料約50 mg，置50 ml量瓶中，再分別精密量取酮洛芬雜質(zhì)A、B、C、D、E、F和酮洛芬乙酯對(duì)照品儲(chǔ)備液各1 ml置同一50 ml量瓶中，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.6雜質(zhì)對(duì)照品溶液? 取酮洛芬雜質(zhì)A、B、C、D、E、F和酮洛芬乙酯對(duì)照品適量，精密稱量，加稀釋劑溶解并稀釋成濃度約為100 μg/ml的雜質(zhì)對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取各雜質(zhì)對(duì)照品儲(chǔ)備液1～50 ml量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，得濃度約為2 μg/ml各雜質(zhì)對(duì)照品溶液。

2.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2.5”項(xiàng)下的系統(tǒng)適用性溶液20 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖（圖1），結(jié)果表明各雜質(zhì)峰與主峰分離度良好，相互之間不會(huì)形成干擾，保留時(shí)間及分離度見(jiàn)表2。

2.4專屬性試驗(yàn)

2.4.1制劑光破壞? 取本品約1 g，精密稱定，置25 ml量瓶中，加稀釋劑約20 ml和氯化鈉2 g，振搖，使氯化鈉溶解，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，置4500Lx±500Lx的強(qiáng)光下照射26 h，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液備用。

2.4.2制劑酸破壞? 取本品約1 g，精密稱定，置25 ml量瓶中，加稀釋劑約20 ml和氯化鈉2 g，加1 mol/L鹽酸溶液2 ml，振搖，使氯化鈉溶解，避光放置4 h后，用1 mol/L氫氧化鈉溶液2 ml中和，再加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液備用。

2.4.3制劑堿破壞? 取本品約1 g，精密稱定，置25 ml量瓶中，加稀釋劑約20 ml和氯化鈉2 g，加1 mol/L氫氧化鈉溶液2 ml，振搖，使氯化鈉溶解，避光放置4 h后，用1 mol/L鹽酸溶液2 ml中和，再加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液備用。

2.4.4制劑熱破壞? 取本品約1 g，精密稱定，置25 ml量瓶中，加稀釋劑約20 ml和氯化鈉2 g，振搖，使氯化鈉溶解，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，置100℃水浴中破壞4 h后，冷卻至室溫，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液備用。

2.4.5氧化破壞? 取本品約1 g，精密稱定，置25 ml量瓶中，加稀釋劑約20 ml和氯化鈉2 g，振搖，使氯化鈉溶解，加30%的H2O2 2 ml，搖勻，避光放置20 h后，于80℃水浴中加熱2 min，冷卻至室溫，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液備用。

按上述擬定的色譜條件，分別取制劑的酸、堿、光、熱、氧化破壞溶液進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果表明，酮洛芬凝膠的酸、堿、光、熱、氧化破壞溶液進(jìn)樣，各降解產(chǎn)物峰與主峰之間的分離度均符合規(guī)定。

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.2.5”項(xiàng)下的系統(tǒng)適用性溶液，在上述擬定的色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6針，結(jié)果表明，各雜質(zhì)及主峰的RSD均<2%，符合藥典要求，詳見(jiàn)表3。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)

取本品凝膠（批號(hào)2017401）按“2.2.1”項(xiàng)下的測(cè)定方法，配置供試品溶液，在室溫下放置0、2、4、6、8、12 h后進(jìn)樣，記錄色譜圖，考察樣品溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，凝膠中雜質(zhì)C峰面積的RSD=0.96%，保留時(shí)間的RSD=0.18%，表明樣品溶液在室溫條件下放置12 h穩(wěn)定。

2.7定量限與檢測(cè)限考察

取雜質(zhì)A、B、C、D、E、F及酮洛芬乙酯對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣進(jìn)行測(cè)定，當(dāng)信噪比（S/N）約為10時(shí)，雜質(zhì)A、B、C、D、E、F及酮洛芬乙酯的定量限分別為0.6、 0.6、1.0、1.6、0.8、1.6、0.8 ng。當(dāng)信噪比（S/N）≥3時(shí)，雜質(zhì)A、B、C、D、E、F及酮洛芬乙酯的檢測(cè)限分別為0.2、0.2、0.3、0.5、0.2、0.5、0.3 ng。

2.8樣品測(cè)定

取批號(hào)為20170401、20170402、20170403三批樣品及市售樣品（269），照上述確定方法檢查其有關(guān)物質(zhì)，結(jié)果見(jiàn)表5。三批樣品及市售樣品均未檢出雜質(zhì)A、雜質(zhì)C、雜質(zhì)F，各樣品中均檢出雜質(zhì)B、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E及酮洛芬乙酯。

3討論

3.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

酮洛芬原料EP 8.0版和USP 38版中有關(guān)物質(zhì)檢查方法為HPLC法，檢測(cè)波長(zhǎng)為233 nm。酮洛芬凝膠進(jìn)口藥品注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法為HPLC法[11]，檢測(cè)波長(zhǎng)為255 nm。取上述“2.2.5”項(xiàng)下的系統(tǒng)適用性溶液各20 μl，分別在255、233 nm的波長(zhǎng)條件下進(jìn)樣，確定各雜質(zhì)與主峰在各波長(zhǎng)條件下的檢出情況。檢測(cè)結(jié)果表明，254 nm波長(zhǎng)條件下雜質(zhì)的檢出效果明顯優(yōu)于233 nm，雜質(zhì)B、D、E、F和酮洛芬乙酯的最大吸收波長(zhǎng)與酮洛芬凝膠進(jìn)口藥品注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)波長(zhǎng)一致。故本實(shí)驗(yàn)將255 nm作為酮洛芬凝膠有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)的波長(zhǎng)，優(yōu)化酮洛芬凝膠有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)條件[12]。

3.2酮洛芬有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法制定

文獻(xiàn)中酮洛芬凝膠有關(guān)物質(zhì)的檢查方法，和EP 8.0版質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)的色譜條件一致[13]。有機(jī)相均為乙腈，水系分別為0.15%三氟乙酸溶液和磷酸鹽緩沖液，水系中鹽的成分均較少，作用是調(diào)整基線和峰形。如果將文獻(xiàn)中梯度洗脫程序中有機(jī)相的比例調(diào)整至和EP 8.0版一致，即將第二步梯度（75 min）的有機(jī)相比例由31%增加到45%，將水系比例由69%降低至55%，同時(shí)對(duì)第三步梯度進(jìn)行修改，即保持換相后的第二步梯度的濃度，以保證酮洛芬乙酯可有效洗脫。按此條件，可以達(dá)到較好的分離效果，且所得圖譜各峰峰形比較好，對(duì)酮洛芬凝膠有關(guān)物質(zhì)[14]的檢測(cè)的色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化。

3.3小結(jié)

《日本藥典》17版[15]、《美國(guó)藥典》40版[16]、《歐洲藥典》8.0版本[17]中均采用HPLC法對(duì)酮洛芬進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)的分析，但僅EP 8.0版[18]中給出了6種已知雜質(zhì)的保留時(shí)間。對(duì)于酮洛芬凝膠制劑的研究則更少[19]，僅BP 13版中收載了有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，但檢測(cè)方法為T(mén)LC法，且僅檢測(cè)了酮洛芬乙酯雜質(zhì)[20]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)酮洛芬凝膠中雜質(zhì)的檢測(cè)進(jìn)行了優(yōu)化：①將USP 38版和EP 8.0版中規(guī)定的C18柱修改成了苯基柱;②將USP 38版和EP 8.0版中規(guī)定的流動(dòng)相體系：磷酸鹽緩沖液-水-乙腈（2∶55∶43）等度洗脫修改了以0.15%三氟乙酸溶液和0.15%三氟乙酸乙腈溶液按一定比例進(jìn)行梯度洗脫的方式。本實(shí)驗(yàn)建立的方法檢查酮洛芬凝膠的有關(guān)物質(zhì)，也為主成分的鑒別及含量測(cè)定提供了依據(jù)。

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（收稿日期：2018-10-18? 本文編輯：許俊琴）