趙東，鄭佳，彭志云，楊康卓，張建敏，劉芳

(宜賓五糧液股份有限公司,四川 宜賓，644007)

五糧液是我國(guó)五糧濃香型白酒的典型代表，具有“香氣悠久、味醇厚、入口甘美、入喉凈爽、各味協(xié)調(diào)、恰到好處，尤以味全面而著稱”的特點(diǎn)。在悠久的釀酒歷史過(guò)程中形成了極為復(fù)雜而獨(dú)特的釀酒工藝，包括5種糧食配方，傳統(tǒng)“包包曲”的制曲工藝、“固態(tài)續(xù)糟” “沸點(diǎn)量水”“雙輪底發(fā)酵”“跑窖循環(huán)”“分層起糟”“分層蒸餾”“量質(zhì)摘酒”“按質(zhì)并壇”等最為突出的傳統(tǒng)釀酒工藝，這些優(yōu)良的傳統(tǒng)釀酒工藝形成的運(yùn)行系統(tǒng)是保證五糧液長(zhǎng)盛不衰的根本[1]。其中以高粱、大米、糯米、小麥、玉米為原料的5種糧食配方是五糧液區(qū)別于其他濃香型白酒的特色之一，是五糧液優(yōu)良品質(zhì)的物質(zhì)保證與基礎(chǔ)[2]。研究表明，5種糧食除了具有相似的淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪外，還在混蒸與發(fā)酵中提供不同的微量香氣成分[3]，比如高粱產(chǎn)酒清香味正、大米產(chǎn)酒醇和甘香、糯米產(chǎn)酒純甜味濃、玉米產(chǎn)酒味香沖鼻、小麥產(chǎn)酒曲香悠長(zhǎng)等，這些微量成分的綜合發(fā)酵形成五糧液獨(dú)特的酒體風(fēng)格。

俗諺道，“千年老窖萬(wàn)年糟，酒好須得窖池老”。泥窖窖池既作為盛裝糟醅的容器外，還具有微生物和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)載體的功能，特別是窖泥中微生物與發(fā)酵糟醅的互動(dòng)情況對(duì)濃香型白酒的酒質(zhì)具有決定性作用。五糧液糟醅是年復(fù)一年反復(fù)使用的所謂“萬(wàn)年糟”。它經(jīng)微生物長(zhǎng)年發(fā)酵，日積月累，糟醅中積攢了大量的微生物代謝產(chǎn)物、微生物菌體自溶物以及原料的分解殘留物，這些物質(zhì)的存在為發(fā)酵提供了復(fù)雜呈香呈味物質(zhì)生成所必需的前體物，也直接為成品酒提供了大量的香味物質(zhì)，形成了窖池糟醅成分的豐富積累。窖泥與糟醅長(zhǎng)期接觸,在糟醅的浸潤(rùn)下，窖泥吸收了大量的酸、酯、醇和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，供給窖泥中棲息的微生物生長(zhǎng)、繁殖。窖池相對(duì)厭氧條件又為以己酸菌為主體的窖泥功能菌群創(chuàng)造了適宜的條件[4]。由于長(zhǎng)期不斷地富集、馴化，使老窖泥中積累了越來(lái)越多的優(yōu)良窖泥功能菌系，從而發(fā)揮出老窖泥特征的生產(chǎn)性能，形成了老窖泥豐富的微生物積累效應(yīng)。且發(fā)酵產(chǎn)生的黃水及糟醅中香味物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累以及對(duì)窖泥的浸潤(rùn)作用，形成了“以糟養(yǎng)窖”“以窖促糟”“窖糟互養(yǎng)”的良性循環(huán)和積累，達(dá)到了穩(wěn)定持續(xù)出好酒的目的。目前，我國(guó)釀酒科研的重心都放在了剖析糟醅—窖泥微生物[5-8]、白酒香氣成分[9-13]等方面，迄今為止，探討窖泥與糟醅間相互關(guān)系的研究工作并沒(méi)有開(kāi)展。

本研究基于頂空固相微萃取(head space solid phase microextraction, HS-SPME)技術(shù)，探討了不同空間糟醅和窖泥中的香氣成分，結(jié)合質(zhì)譜匹配度和保留指數(shù)進(jìn)行成分的定性和內(nèi)標(biāo)定量法，獲得較為全面的糟醅香氣成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)；并基于多元統(tǒng)計(jì)分析方法探討了糟醅與窖泥之間香氣成分的相互影響關(guān)系，以期為探討窖泥對(duì)酒質(zhì)的影響提供數(shù)據(jù)支撐，為實(shí)際生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

所有樣品均采自宜賓五糧液股份有限公司釀酒車(chē)間，窖池窖齡約40年。

糟醅采集方法：如圖1中灰色點(diǎn)所示，將窖池中糟醅垂直中線分為5個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)采集3個(gè)平行樣品，分別取500 g，混合均勻。其中，Z1為窖帽糟醅，Z2為中上層糟醅(距地面約20 cm)，Z2-1為Z2對(duì)應(yīng)的窖中心糟，Z3為中下層糟醅(距黃水線約20 cm)，Z3-1為Z3對(duì)應(yīng)的中心糟，Z4為下層糟醅(黃水線下10 cm)，Z4-1為Z4對(duì)應(yīng)中心糟，Z5為窖底糟醅，Z5-1為Z5對(duì)應(yīng)的中心糟。

窖泥采集方法：如圖1中黑色點(diǎn)所示，與糟醅對(duì)應(yīng)位置窖壁上，間隔10 cm，取3個(gè)平行樣，分別取50 g， 混合均勻。其中，編號(hào)為1#，2#，3#，4#，5#的窖泥均與上述糟醅的取樣位置相對(duì)應(yīng)。

圖1 糟醅和窖泥的取樣位置Fig.1 Sampling positions of fermented grains and pit mud

1.1.2 樣品前處理

取100 g樣品置于冰箱中，-20 ℃完全冷凍，再將樣品置于攪拌機(jī)中，攪拌均勻，待用。

1.1.3 試劑和儀器

C7-C30直鏈正構(gòu)烷烴購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

式中,K為比例系數(shù)。結(jié)合等效電路(圖2)進(jìn)行分析,球形電容傳感器球殼上的感應(yīng)電荷在測(cè)量電容CM上產(chǎn)生一個(gè)微小的電壓,其電壓UM(t)為

攪拌機(jī)，Philips公司；頂空固相微萃取手柄、50/30 μm CAR/DVB/PDMS Stableflex纖維萃取頭，美國(guó)Supelco公司；6890N-5973MSD氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent公司；DB-WAX石英毛細(xì)管色譜柱(30.0 m×0.25 mm ×0.25 μm)，J&W美國(guó)安捷倫公司。

1.2 HS-SPME提取方法

稱取2 g處理好的樣品于20 mL頂空樣品瓶中，加入定量?jī)?nèi)標(biāo)(4-辛醇，5.5 mg)，置于50 ℃水浴中平衡15 min，插入萃取頭吸附45 min，隨后插入GC進(jìn)樣口熱解析5 min，分析其中香氣成分。每個(gè)樣品分析3個(gè)平行。

1.3 氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)條件

氣相色譜條件如下所述：進(jìn)樣口溫度250 ℃，載氣(He)流速1 mL/min，不分流模式進(jìn)樣；氣相色譜升溫程序?yàn)椋浩鹗贾鶞?0 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升至230 ℃，保持15 min。

質(zhì)譜條件為：質(zhì)譜EI源，電子轟擊能量70 eV；離子源溫度200 ℃，四級(jí)桿溫度150 ℃；質(zhì)量數(shù)掃描范圍35～350 amu。

1.4 物質(zhì)的定性與定量

香氣成分的鑒定采用以下方法：首先將化合物的質(zhì)譜圖與NIST08標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)(美國(guó)Agilent公司化學(xué)工作站內(nèi)置)中的標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行比對(duì)，匹配度>800(最大值1 000)，作為初步定性結(jié)果。再計(jì)算各物質(zhì)的Kovat’s保留指數(shù)(RI)，并與文獻(xiàn)報(bào)道的保留指數(shù)值進(jìn)行比較，確定該物質(zhì)的歸屬。其中，RI計(jì)算方法參考文獻(xiàn)[14]所述。

香氣成分的定量結(jié)果基于Agilent化學(xué)工作站獲得，各成分的含量以其峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比計(jì)算，均采用定量離子定量，含量單位為μg/g(n=3)。

1.5 主成分分析

利用SPSS 16.0軟件(美國(guó)SPSS公司)中因子分析(component analysis)工具進(jìn)行不同窖泥的主成分分析，計(jì)算參數(shù)：計(jì)算方法為主成分、分析基于相關(guān)性矩陣、主成分抽取基于特征值(大于1)、最大收斂迭代次數(shù)為25。

2 結(jié)果與討論

2.1 糟醅與窖泥香氣成分總含量的比較

分別以不同空間位置的窖邊糟、中心糟和對(duì)應(yīng)窖泥為研究對(duì)象，GC-MS測(cè)定其中含有的香氣成分。結(jié)果如圖2所示，該圖展示了部分糟醅、窖泥樣品香氣成分的豐度信息，圖2可知，不同樣品間香氣成分的豐度是完全不同的，如窖邊糟(Z5)和中心糟(Z5-1)的區(qū)別十分明顯，窖帽泥(1#)和窖底泥(5#)的區(qū)別也是十分顯著的。

圖2 糟醅窖泥的香氣成分總離子流圖Fig.2 Total ion chromatograms of volatile compounds in fermented grains and pit mud

在不同空間位置糟醅和窖泥中共定量檢出了97種香氣組分，其中57種酯、10種酸、12種醇、3種醛酮、12種芳香族和3種其他成分?？偤康谋容^結(jié)果如圖3所示，中上層和中下層窖泥(1#和2#)的香氣成分總含量低于同層糟醅(Z2，Z2-1，Z3，Z3-1)，而黃水線以下的窖泥的香氣成分則顯著高于同層糟醅。黃水線以下窖泥的香氣成分總量較高，4#最高，為2 831 μg/g。對(duì)糟醅而言，窖邊糟的總含量均大于中心糟，如Z2為535.7 μg/g，是Z2-1的2.9倍，Z4為1 949.5 μg/g，是Z4-1的2倍。這可能是由于糟醅發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的黃水在窖池中往往下滲至窖池底部，黃水線以下的窖泥長(zhǎng)期與糟醅接觸而吸收大量黃水中的成分，進(jìn)而黃水線以下窖泥的香氣成分的含量高于同層糟醅。

圖3 糟醅、窖泥香氣組分總含量的空間分布規(guī)律Fig.3 Spatial variation of total concentration of volatile compounds in fermented grains and pit mud

2.2 糟醅與窖泥的關(guān)系

2.2.1 窖邊糟與中心糟的關(guān)系

如圖4所示，不同層次窖邊糟(Z2、Z3、Z4和Z5)的含量均是顯著高于中心糟(Z2-1、Z3-1、Z4-1和Z5-1)。這可能是由于在濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中，窖泥與糟醅長(zhǎng)期接觸，在窖邊糟醅吸收來(lái)自于窖泥的營(yíng)養(yǎng)成分和香氣及前體物質(zhì)，進(jìn)而形成與中心糟醅相區(qū)別的香氣物質(zhì)。

圖4 窖邊糟和中心糟香氣成分含量比較Fig.4 Comparison of volatile compounds between edge and central fermented grains

2.2.2 窖泥與糟醅中香氣成分的關(guān)系

表1為糟醅與窖泥中香氣成分的含量，可見(jiàn)諸多濃香型白酒優(yōu)勢(shì)香氣成分在窖邊糟的含量顯著高于中心糟，且在窖泥中的含量較高，包括己酸甲酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、己酸己酯、苯乙酸乙酯、苯丙酸乙酯、丁酸、己酸等。

酯類成分是濃香型白酒中含量最豐富的一類化合物。其中，乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、庚酸乙酯等在過(guò)去的研究中已經(jīng)證實(shí)在濃香型白酒的香氣貢獻(xiàn)值是最大的一類化合物[15]。這類化合物呈濃郁的果香味，如香蕉、蘋(píng)果、菠蘿等水果香氣，尤其是己酸乙酯具有強(qiáng)烈的酒香、菠蘿以及香蕉等香氣特征。本研究中，酯類對(duì)糟醅香氣的貢獻(xiàn)度最大糟醅中酯類成分占總含量的63%～82%(圖4)，檢出的57種酯中，乙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸甲酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯、己酸丁酯、辛酸乙酯、己酸戊酯、己酸己酯、苯乙酸乙酯和棕櫚酸乙酯是優(yōu)勢(shì)成分。類似的，同香型的非五糧糟醅中也檢出了29種酯類成分[16]，占總含量的65%，己酸乙酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯和棕櫚酸乙酯是其豐度較高的酯。這說(shuō)明五糧濃香與非五糧濃香在糟醅酯香存在著顯著的差異。

李恒等[17]比較了濃香型窖壁和窖底泥香氣成分的差異性，認(rèn)為己酸、己酸丁酯、己酸己酯是窖壁泥的主要成分，而窖底泥中同時(shí)含有豐富的己酸甲酯。本研究中，窖泥中的酯類成分與糟醅中的含量基本持平或略低于糟醅(表1)，且數(shù)量基本一致，檢出了酯類數(shù)量較多，而這些酯類成分不僅僅局限于乙酯類化合物，且優(yōu)勢(shì)酯類成分包括乙酸乙酯、戊酸乙酯、己酸甲酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸甲酯、辛酸乙酯、己酸己酯、己酸丁酯、癸酸乙酯、辛酸丁酯等。可能是由于糟醅是酸醇酯化反應(yīng)發(fā)生的主要場(chǎng)所，而窖泥中檢出的酯類則是從糟醅轉(zhuǎn)移至窖泥并在長(zhǎng)期的生產(chǎn)過(guò)程中日積月累而成。

酸類成分是窖池中生成酯類物質(zhì)的前驅(qū)物(或者前體物)，本研究中共檢出了11種有機(jī)酸(表1)，其中，己酸、丁酸和乙酸是糟醅中的主要酸類，窖泥中除了這些外還包括庚酸和辛酸。值得注意的是，窖泥中有機(jī)酸的含量明顯高于糟醅(表1)，說(shuō)明窖泥是有機(jī)酸合成代謝的主要場(chǎng)所。

表1 不同空間位置糟醅及窖泥的香氣成分Table 1 Spatial variation of volatile compounds in fermented grains and pit mud

續(xù)表1

這可能是由于窖泥中產(chǎn)生的有機(jī)酸通過(guò)窖池的“物質(zhì)內(nèi)循環(huán)”轉(zhuǎn)移到了相接觸的糟醅，糟醅發(fā)酵過(guò)程中，水蒸氣的作用進(jìn)而將有機(jī)酸轉(zhuǎn)移到不同空間位置的糟醅中。

酸類成分呈典型的酸澀味、臭腳丫、汗臭等不愉快氣味[18-19]，窖泥中較高含量的有機(jī)酸可能會(huì)削弱酯類物質(zhì)的果香味，而使得窖泥中香氣特征與糟醅截然不同。

芳香族成分中，除Z3中對(duì)甲酚含量較高，對(duì)甲酚在窖泥中的含量均高于糟醅。對(duì)甲酚在空氣中的閾值是0.12 μg/L，并呈強(qiáng)烈的煙熏味、苯酚味、馬廄味等不愉快氣味，因此，較高含量的對(duì)甲酚將極大影響糟醅和窖泥的香氣特征。

2.3 基于香氣成分的糟醅和窖泥關(guān)系的主成分分析

基于香氣成分的糟醅與窖泥關(guān)系的PCA表明(圖5)，主成分1(PC1)的貢獻(xiàn)率為81%，主成分2(PC2)的貢獻(xiàn)率為19%，表征了整體數(shù)據(jù)的信息特征。其中，PC1的貢獻(xiàn)率最大，表征了各種樣品間的區(qū)別與聯(lián)系。根據(jù)在PC1軸上的載荷值，可將不同樣品進(jìn)行區(qū)分，窖泥1#、2#、3#在PC1上的載荷值較其他樣品小，中心糟樣品(Z1-1到Z5-1)則聚集在載荷值為0.9附近(圖中圓圈內(nèi))，窖邊糟Z2到Z5則位于載荷值為1附近(各樣品間的區(qū)別也可根據(jù)PC2載荷值而區(qū)分)。

圖5 基于香氣成分的窖泥糟醅關(guān)系PCA載荷圖Fig.5 PCA loading plot of fermented grains and pit mud based on volatile compounds.

3 結(jié)論

五糧配方的糟醅在窖池發(fā)酵過(guò)程中，不僅為釀酒功能微生物提供了增殖代謝的場(chǎng)所，也為窖泥中棲息的特殊功能微生物提供了必要的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，糟醅與窖泥相接觸，窖泥中的微生物與香氣物質(zhì)不斷地與糟醅發(fā)生著相互交換。本文探討了不同空間位置的五糧液糟醅與對(duì)應(yīng)窖泥的香氣成分的異同點(diǎn)，結(jié)果表明，窖邊糟與窖泥之間香氣成分的交換效果明顯，窖邊糟中特殊香氣成分的含量較中心糟的高，較高含量的有機(jī)酸和對(duì)甲酚可能是造成窖泥出現(xiàn)有別于糟醅香氣特征的緣由之一。

五糧液獨(dú)特的釀酒生態(tài)環(huán)境為形成五糧液特殊酒體風(fēng)格提供了不可復(fù)制的微生物群落。目前，我們正在積極開(kāi)展窖泥微生物群落與糟醅微生物群落的相關(guān)性研究以及在五糧液傳統(tǒng)工藝條件下的微生物群落的生理代謝特征研究，以期實(shí)現(xiàn)五糧液釀造可控化目標(biāo)。