紀(jì)凌云， 周愛萍， 馬 俊， 金 寧， 譚光坤， 吳文娟

作者單位：同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，上海 200123。

近年來(lái)，隨著廣譜抗菌藥物、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用，以及各種介入診療、器官移植的大量開展，念珠菌病的發(fā)病率逐漸升高。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)，發(fā)生侵襲性念珠菌感染的患者達(dá)25萬(wàn)例/年，死亡病例超過(guò)5萬(wàn)例，年發(fā)病率在（2～14）/100 000[1-2]。白念珠菌是一種定植在正常人群口腔黏膜、上呼吸道、腸道及陰道等部位的酵母樣真菌，為條件致病性真菌。近十年來(lái)，越來(lái)越多的其他念珠菌種被發(fā)現(xiàn)或成為重要的病原菌，使得菌種分布發(fā)生了變化，但白念珠菌占比達(dá)50%，仍占主要地位[3]。唑類藥物是目前治療白念珠菌感染的首選藥物，隨著長(zhǎng)期廣泛大量使用，對(duì)其耐藥導(dǎo)致治療失敗的病例逐漸增多。本文就白念珠菌耐藥相關(guān)機(jī)制的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，并探討非整倍體事件、適應(yīng)性、生物膜形成與耐藥形成的聯(lián)系，為抗真菌藥物的研制提供新的作用靶位。

1 麥角固醇合成相關(guān)基因

麥角固醇是維持白念珠菌細(xì)胞膜完整性和流動(dòng)性的重要組成部分，CYP51是其生物合成的靶酶，可催化羊毛甾醇去甲基化形成麥角固醇，且該反應(yīng)離不開氧和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH，還原型輔酶Ⅱ）。唑類藥物抗真菌的作用靶點(diǎn)即去甲基化酶CYP51，其通過(guò)易化擴(kuò)散進(jìn)入真菌細(xì)胞，并通過(guò)唑環(huán)中的無(wú)阻氮原子與位于CYP51蛋白活性位點(diǎn)血紅素的鐵原子結(jié)合，從而抑制麥角甾醇的生物合成而發(fā)揮抗真菌作用[4]。細(xì)胞色素P450是一個(gè)包含2 500多個(gè)成員的超家族，按功能可大致將其分為兩類，第一類主要參與有害物質(zhì)的代謝，而第二類通常參與關(guān)鍵的生物合成過(guò)程，如甾醇類[5]。CYP51是細(xì)胞色素P450家族中最古老的，它是該家族中唯一一個(gè)在動(dòng)物、植物、細(xì)菌以及病毒中均存在的蛋白，盡管在不同生物中，CYP51蛋白序列一致性為22%～33%，發(fā)揮效用的晶體結(jié)構(gòu)卻有許多相似之處，而白念珠菌和其他真菌在結(jié)構(gòu)上最顯著的特征是在氨基酸428和459之間有一個(gè)附加的外環(huán)[4]。編碼CYP51的基因主要是ERG1～27，其中與耐藥相關(guān)的基因主要是ERG11，此外ERG3、ERG4、ERG5、ERG6與耐藥的相關(guān)性也有所報(bào)道[6-9]。

1.1 ERG11基因突變與過(guò)表達(dá)

ERG11基因突變可使唑類藥物抗真菌的作用靶點(diǎn)去甲基化酶CYP51的血紅素表面結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生變化，從而使唑類藥物無(wú)法與真菌有效結(jié)合而致耐藥。據(jù)報(bào)道超過(guò)140個(gè)錯(cuò)義突變存在于ERG11基因，表明其編碼產(chǎn)物去甲基化酶CYP51在結(jié)構(gòu)上具有高度的可變性[10]。此外，只有部分錯(cuò)義突變被明確證實(shí)與耐藥有關(guān)，且大部分已發(fā)現(xiàn)的耐藥株均含有多個(gè)錯(cuò)義突變。早在1999年，這些錯(cuò)義突變已被證實(shí)并非隨機(jī)分布在整個(gè)編碼區(qū)，多數(shù)集中在不同的“熱點(diǎn)”區(qū)，表現(xiàn)在蛋白質(zhì)水平為：氨基酸突變位點(diǎn)區(qū)域105-165、266-287、405-488[6]。與唑類耐藥相關(guān)的ERG11突變位點(diǎn)見表1[4，6-7，10-11]。此外，ERG11基因突變位點(diǎn)具有地域相關(guān)性，特定區(qū)域具有相同的突變位點(diǎn)，未發(fā)生突變的分離株對(duì)于唑類藥物具有較低的最低抑菌濃度（MIC）值，總之，ERG11基因點(diǎn)突變?cè)诎啄钪榫蝾惸退幹邪l(fā)揮重要作用[12]。值得注意的是，一些位點(diǎn)的ERG11基因突變?cè)谶蝾惷舾兄旰湍退幹曛芯砂l(fā)生，故這些突變不影響其對(duì)唑類耐 藥。

ERG11基因過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致去甲基化酶CYP51增多，白念珠菌胞內(nèi)的唑類藥物不能夠阻止過(guò)多的去甲基化酶CYP51與羊毛甾醇結(jié)合，無(wú)法影響麥角固醇的合成，從而導(dǎo)致白念珠菌耐藥[6，11]。ERG11基因過(guò)表達(dá)在白念珠菌臨床分離株中普遍存在，白念株菌唑類藥物耐藥機(jī)制中，ERG11基因過(guò)表達(dá)作用是最小的，或者與其他抗性突變機(jī)制聯(lián)合，使得菌株產(chǎn)生耐藥，因此難以評(píng)估這種過(guò)表達(dá)對(duì)耐藥表型的直接影響，且這種過(guò)表達(dá)往往涉及鋅簇轉(zhuǎn)錄因子Upc2p，該轉(zhuǎn)錄因子在麥角固醇耗竭基礎(chǔ)上誘導(dǎo)產(chǎn)生[6]。文獻(xiàn)報(bào)道，UPC2基因的功能獲得性（gain-of-function，GOF）突變能夠改變其轉(zhuǎn)錄活性，導(dǎo)致ERG11基因的過(guò)表達(dá)，該研究結(jié)果顯示，在沒有藥物影響下，野生型與UPC2基因敲除株表現(xiàn)出相同的生長(zhǎng)情況，在2 μg/ mL氟康唑作用下，UPC2基因敲除株生長(zhǎng)與野生型相比受到嚴(yán)重?fù)p害[13]。UPC2基因的GOF突變可導(dǎo)致白念珠菌對(duì)唑類藥物耐藥，據(jù)報(bào)道轉(zhuǎn)錄因子UPC2中的A643V、G648D、G648S和Y642F位點(diǎn)的氨基酸置換與ERG11基因的過(guò)表達(dá)有關(guān)，而且UPC2基因的GOF突變?cè)谂R床分離的耐藥株中普遍存在[14]。此外，也有報(bào)道稱，ERG11基因過(guò)表達(dá)僅發(fā)生在少數(shù)近平滑念珠菌臨床耐藥株中，且過(guò)表達(dá)不依賴UPC2基因突變。在光滑念珠菌的唑類耐藥機(jī)制中，ERG11過(guò)表達(dá)并不起重要作用，該機(jī)制在克柔念珠菌的唑類耐藥中的作用也尚不清楚[6]。因此，隨著研究的深入，UPC2基因更多新的GOF突變位點(diǎn)有待發(fā)現(xiàn)，對(duì)ERG11基因過(guò)表達(dá)的調(diào)控機(jī)制也會(huì)有更多全新認(rèn)識(shí)。

表1 白念珠菌唑類耐藥相關(guān)的ERG11突變位點(diǎn)

1.2 其他ERG耐藥相關(guān)基因

ERG3基因位于ERG11基因上游，與甾醇生物合成的旁路途徑有關(guān)，引起氟康唑耐藥現(xiàn)象發(fā)生。該基因的功能缺失突變導(dǎo)致菌體不能生成有活性的甾醇△5，6-去飽和酶，菌體內(nèi)毒性麥角甾醇類物質(zhì)聚集，并且能夠維持菌株的正常生長(zhǎng)，從而減弱唑類藥物對(duì)細(xì)胞壁的作用，該耐藥機(jī)制較罕見，已在實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)發(fā)生，并在臨床株中觀察到此現(xiàn)象[6]。ERG4基因編碼甾醇C-24（28）還原酶，在釀酒酵母中過(guò)表達(dá)可升高麥角甾醇含量。據(jù)報(bào)道，ERG4及ERG11基因突變及過(guò)表達(dá)發(fā)生在唑類耐藥株中，且ERG4在唑類耐藥株中存在2個(gè)沉默突變（C711T和C435T），但不能確定此突變與耐藥相關(guān)[7]。此外，也有報(bào)道表明ERG5與唑類的耐藥性相關(guān)[9]，艾里莫芬倍半萜（eudesmane sesquiterpenes）能夠作用于ERG6及ERG11從而發(fā)揮抗真菌作用[8]。

2 外排泵相關(guān)耐藥基因

白念珠菌細(xì)胞膜上的外排泵活力增強(qiáng)是白念珠菌對(duì)唑類藥物耐藥的主要機(jī)制之一，主要有2類外排泵蛋白：擁有ATP結(jié)合盒結(jié)構(gòu)（ATP-binding cassette，ABC）的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族和主要易化載體超家族（major facilitator superfamily，MFS）。

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族依賴ATP水解的能量，具有廣泛的底物特異性，在預(yù)測(cè)的28種ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中，只有Cdr1p和Cdr2p與唑類藥物的耐藥相關(guān)，CDR1和CDR2基因的過(guò)表達(dá)使外排泵泵出藥物能力增強(qiáng)，從而導(dǎo)致白念珠菌對(duì)唑類藥物耐藥，此外，許多氟康唑耐藥株過(guò)表達(dá)CDR1和CDR2，其中1個(gè)或2個(gè)基因的缺失會(huì)導(dǎo)致分離株耐藥性下降[15-16]。CDR1和CDR2基因的過(guò)表達(dá)與基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控有關(guān)，由TAC1基因編碼的CDR基因轉(zhuǎn)錄激活因子l（transcriptional activator ofCDRgene l，Tac1）介導(dǎo)CDR1和CDR2基因過(guò)表達(dá)，從而使外排泵活性增強(qiáng)導(dǎo)致耐藥。TAC1基因具有高度多態(tài)性，目前已發(fā)現(xiàn)19個(gè)GOF突變位點(diǎn)，隨著研究的深入，更多GOF突變將被證實(shí)。這些GOF突變都擁有促使外排泵活性增強(qiáng)的調(diào)控機(jī)制，從而導(dǎo)致白念珠菌產(chǎn)生耐藥[17-18]。

與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族相比，MFS類具有較窄的底物特異性，依賴電化學(xué)質(zhì)子動(dòng)力。在白念珠菌基因組預(yù)測(cè)的約95種MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中，只有Mdr1p與氟康唑耐藥相關(guān)；許多氟康唑耐藥株過(guò)表達(dá)MDR1，該基因的缺失會(huì)導(dǎo)致分離株耐藥性下降。Mdr1p表達(dá)由轉(zhuǎn)錄因子mrr1p調(diào)控，該因子點(diǎn)突變可誘導(dǎo)MDR1過(guò)表達(dá)，目前已發(fā)現(xiàn)15種不同GOF突變位點(diǎn)[6]。

3 潛在的耐藥相關(guān)基因

3.1 SRB1

SRB1編碼的甘露糖焦磷酸化酶（GDP-mannose pyrophosphorylase）是參與細(xì)胞壁甘露聚糖合成的關(guān)鍵催化酶，催化甘露糖-1-磷酸和GTP生成GDP甘露糖從而穩(wěn)定細(xì)胞形態(tài)，還可通過(guò)糖基修飾影響細(xì)胞整體功能。Warits等[19]對(duì)釀酒酵母SRB1進(jìn)行了克隆及測(cè)序，這是對(duì)念珠菌SRB1首次系統(tǒng)性描述，該基因在調(diào)節(jié)白念珠菌細(xì)胞周期中發(fā)揮重要作用，且該基因在2種念珠菌的分子克隆水平具有同源性。隨后，Warits等[20]首先指出該編碼基因受啟動(dòng)子CAMET3的調(diào)控，且編碼產(chǎn)物與白念珠菌細(xì)胞分離和/或胞質(zhì)分裂、出芽生長(zhǎng)、菌絲形態(tài)轉(zhuǎn)換等有關(guān)，并對(duì)多種抗真菌藥物和細(xì)胞壁抑制劑敏感，這表明casrb1可能是抗真菌藥物治療靶位。直到2008年，Warits等[21]發(fā)現(xiàn)新型隱球菌SRB1cDNA被克隆并證明能夠產(chǎn)生甘露糖焦磷酸化酶，因此推測(cè)該編碼基因可用于新的抗隱球菌化合物的篩選。高來(lái)強(qiáng)等[22]在最近的研究首次提出SRB1與白念珠菌氟康唑耐藥密切相關(guān)，然而，通過(guò)檢索文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于白念珠菌SRB1在氟康唑敏感株與耐藥株的表達(dá)差異并無(wú)系統(tǒng)研究，因此，這對(duì)白念珠菌新耐藥機(jī)制的研究提供了新思 路。

3.2 CSC1

CSC1即VPS4/END13，編碼48 kDa的AAA-型ATP酶（AAA-type ATPases），參與細(xì)胞膜運(yùn)輸，與內(nèi)吞作用等活動(dòng)相關(guān)[23]。早期研究發(fā)現(xiàn)CSC1-1等位基因是在AAA-type ATPases家族中高度保守的CSC1開放閱讀框發(fā)生錯(cuò)義突變，從而導(dǎo)致自噬，同時(shí)在野生型中不會(huì)引發(fā)自噬，提示CSC1開放閱讀框的獲得性功能突變與自噬相關(guān)，這為縮短葡萄酒發(fā)酵時(shí)間提供了新思路[24]。在最近的研究中發(fā)現(xiàn)，白念珠菌CaCSC1缺失株對(duì)酮康唑敏感，因此CSC1可能與白念珠菌酮康唑耐藥相關(guān)，且白念珠菌臨床耐藥株CaCSC1基因是否有高表達(dá)值得研究[25]。

3.3 凝集素樣序列（ALS）家族

早在1995年首次被發(fā)現(xiàn)，隨后在2001年完成ALS家族中8個(gè)基因測(cè)序（ALS1-ALS7和ALS9）。大多數(shù)Alsp具有附著功能，特別是Als3p，能夠附著到內(nèi)皮細(xì)胞或者表皮細(xì)胞，在黏附宿主細(xì)胞、生物膜形成、入侵宿主細(xì)胞、鐵獲取等多個(gè)附著進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[26]。此外，調(diào)節(jié)ALS3的轉(zhuǎn)錄因子很多，包括Efg1p、Cph1p、Tec1p、Bcr1p、Nrg1p、Rfg1p和Tup1p等[26]。雖然已對(duì)白念珠菌ALS家族生物學(xué)方面進(jìn)行了研究，且槲皮素已被證實(shí)能夠抵抗白念珠菌生物膜，從而對(duì)臨床陰道念珠菌病抗真菌藥提供思路，但我們?nèi)钥梢酝茰y(cè)，到目前為止仍存在未知的宿主細(xì)胞作用位點(diǎn)，這將有助于揭示白念珠菌附著、生物膜形成等機(jī)制，從而開發(fā)預(yù)防及治療白念珠菌病的藥物[27]。

3.4 耐藥相關(guān)ORF

眾所周知，白念珠菌的基因組包含28個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，最常見的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由CDR基因家族編碼[28]。CDR1、CDR2與白念珠菌臨床株耐藥相關(guān)，而CDR3和CDR4具有磷脂翻轉(zhuǎn)酶功能[29]。開放閱讀框orf19.4531編碼一種ABC假定轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，導(dǎo)致念珠菌對(duì)唑類藥物耐藥，而對(duì)2種多烯類抗真菌藥物（兩性霉素B和制霉菌素）以及麥角甾醇合成通路抑制劑無(wú)抵抗作用。開放閱讀框orf19.4531與液泡膜相關(guān)，轉(zhuǎn)錄因子Tac1可同步上調(diào)其與CDR1、CDR2，據(jù)報(bào)道該基因已在4株唑類耐藥株發(fā)揮作用[30]。開放閱讀框orf19.7119編碼TFIIH復(fù)合群中的一個(gè)組成部分Rad3解旋酶，在轉(zhuǎn)錄及核苷酸切除修復(fù)（nucleotide excision repair ，NER）中發(fā)揮重要作用，從而維持基因組的完整性及多樣性[31]。此外，白念珠菌開放閱讀框orf19.3727，與植酸酶活性、菌絲形成、上皮細(xì)胞黏附等相關(guān)，在真菌致病過(guò)程發(fā)揮關(guān)鍵作用，為研究抗真菌藥物提供了新思路[32]。

4 雜合性缺失（loss-of-heterozygosity，LOH）

LOH位于一對(duì)同源染色體上的相同基因座位2個(gè)等位基因中的1個(gè)（或其中部分核苷酸片段）發(fā)生缺失，與之配對(duì)的染色體上仍然存在。據(jù)報(bào)道，LOH與白念珠菌氟康唑耐藥具有相關(guān)性，高復(fù)發(fā)的LOH發(fā)生在白念珠菌3號(hào)染色體的右臂，5號(hào)染色體的左臂，其中，在3號(hào)染色體上，存在編碼外排泵的相關(guān)基因CDR1、CDR2及調(diào)節(jié)MDR1家族的轉(zhuǎn)錄因子Mrr1。5號(hào)染色體上存在編碼唑類藥物作用靶點(diǎn)的相關(guān)基因ERG11，此外，還有調(diào)節(jié)CDR1、CDR2表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子Tac1[33]?？梢姡琇OH白念珠菌耐藥現(xiàn)象存在聯(lián)系，并再一次證明已知耐藥基因的作用。

5 適應(yīng)性

Ford等[33]研究報(bào)道，無(wú)藥物存在時(shí)，MIC與適應(yīng)性呈負(fù)相關(guān)，當(dāng)有藥物存在時(shí)，與MIC一致，臨床菌株可表現(xiàn)出相對(duì)增強(qiáng)的適應(yīng)性，表明在沒有選擇壓力（即不存在藥物）時(shí)，白念珠菌獲得性功能突變諸如MRR1、TAC1、UPC2等，與適應(yīng)性降低有關(guān)。Ford等[33]找到了240個(gè)可能與適應(yīng)性相關(guān)的多態(tài)性基因，并根據(jù)不同的功能分為5大集群：集群1富集細(xì)胞壁和細(xì)胞表面基因，集群2是與細(xì)胞周期和壓力有關(guān)的基因，集群3參與藥物反應(yīng)的基因，集群5與碳水化合物結(jié)合有關(guān)。此外，ERG11某些特定位點(diǎn)的基因突變?cè)谝疬蝾惸退幫瑫r(shí)，也與適應(yīng)性及酶的催化活性有關(guān)[34-35]。因此有必要進(jìn)一步探討ERG11基因突變?nèi)绾斡绊懓啄钪榫倪m應(yīng)性。

6 生物膜的形成

白念珠菌生物膜的形成經(jīng)過(guò)表面黏附、成絲、成熟、最終分散等一系列過(guò)程，可導(dǎo)致白念珠菌在體外藥物敏感試驗(yàn)中敏感但體內(nèi)治療無(wú)效的結(jié)果。白念珠菌生物膜耐藥機(jī)制復(fù)雜，目前相關(guān)耐藥基因也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。Nobile等[36]最早證實(shí)菌絲壁蛋白1（hyphal wall protein l，Hwp1）是白念珠菌體內(nèi)生物膜形成所必須的物質(zhì)，該基因的表達(dá)受到鋅簇轉(zhuǎn)錄因子Bcr1的調(diào)控。黏附是白念珠菌生物膜形成的關(guān)鍵步驟，該過(guò)程有望揭示新的白念珠菌耐藥機(jī)制從而防止白念珠菌對(duì)人類健康造成威脅。有研究表明，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑環(huán)孢菌素A（CsA）和FK506通過(guò)抑制白念珠菌生物膜的形成，并抑制其黏附、菌絲形成等相關(guān)基因的表達(dá)，降低細(xì)胞表面疏水性、增加細(xì)胞內(nèi)鈣濃度及藥物轉(zhuǎn)運(yùn)，從而增強(qiáng)臨床上產(chǎn)生生物膜的白念珠菌對(duì)氟康唑的敏感性。該機(jī)制涉及的黏附相關(guān)基因ALS3、菌絲相關(guān)基因HWP1、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白耐藥基因CDR1和MDR1以及FLC靶向作用基因ERG11[37]。

綜上所述，白念珠菌唑類耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生并非由于單一機(jī)制的調(diào)控，而是多種機(jī)制引起，隨著時(shí)間的推移逐步產(chǎn)生高水平的耐藥性。隨著更多耐藥基因的發(fā)現(xiàn)與研究，眾多耐藥機(jī)制聯(lián)合起來(lái)可以讓我們更深刻地認(rèn)識(shí)白念珠菌，同時(shí)有望找到新的藥物治療靶點(diǎn)。