方強(qiáng)強(qiáng)，王 燕

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巖陀DNA提取方法研究

方強(qiáng)強(qiáng)，*王 燕

(大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南，大理 671000)

以巖陀植物嫩葉為材料，用不同方法對(duì)巖陀葉片DNA進(jìn)行提取，比較提取的質(zhì)量差異，尋找適合巖陀葉片總DNA的提取方法，以滿足多基原民族藥巖陀DNA條形碼識(shí)別系統(tǒng)構(gòu)建的研究需要。采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法、改良的CTAB法、十二烷基硫酸鈉（SDS）法及堿裂解法提取巖陀葉片總DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳、紫外分光光度法及PCR擴(kuò)增效果檢查DNA提取的質(zhì)量。結(jié)果顯示四種方法均能從巖陀植物葉片中提取到基因組DNA，改良CTAB法提取的DNA純度和完整性明顯好于其他方法，且采用此法進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的目標(biāo)條帶明亮單一，擴(kuò)增效率達(dá)到100%。改良的CTAB法是巖陀葉片總DNA的提取中最為合適的提取方法，能夠滿足后續(xù)DNA條形碼的研究需要。

巖陀；DNA提??；十六烷基三甲基溴化氨法；十二烷基硫酸鈉法，堿裂解法

巖陀藥材來(lái)源于西南鬼燈檠（Hemsl.）、羽葉鬼燈檠（Hemsl.）或七葉鬼燈檠（Hemsl.）的干燥根莖，屬多年生直立草本植物，系虎耳草科鬼燈檠屬，為白族、傈僳族等民族習(xí)用藥材。在《全國(guó)中草藥匯編》第二、三版及《中華本草》第十卷等中藥材書籍中均有收載。該藥材具有清熱解毒、收斂、消炎、祛風(fēng)、除濕等功效，可用于腸炎、菌痢、風(fēng)濕骨痛、外傷出血、老年性支氣管炎等常見(jiàn)疾病有較好療效。巖陀以根莖入藥，是我國(guó)西南地區(qū)常用民族藥材，主要分布于我國(guó)云南、貴州、四川等高海拔地區(qū)，尤其以云南省資源最為豐富[1-4]。一方面，三種鬼燈檠（七葉鬼燈檠、西南鬼燈檠和羽葉鬼燈檠）的花、葉等主要器官形態(tài)相近，根的外部形態(tài)和內(nèi)部構(gòu)造相似性極高，顯微鑒別、理化鑒別等傳統(tǒng)鑒別方法很難把三者有效地區(qū)分開來(lái)。長(zhǎng)期以來(lái)，巖陀品種問(wèn)題一直存在爭(zhēng)議，各種文獻(xiàn)表述不一，致使來(lái)源于三種鬼燈檠的巖陀藥材均在流通并混淆使用，用藥的安全有效穩(wěn)定性難以保證；另一方面，巖陀根莖的主要成分是巖白菜素，我國(guó)西南地區(qū)的制藥企業(yè)生產(chǎn)巖白菜素主要依靠采挖野生植物資源，巖陀及其近緣種多生長(zhǎng)于高海拔地區(qū)，長(zhǎng)期過(guò)度采挖導(dǎo)致野生資源急劇下降。

DNA條形碼是利用基因組中一段標(biāo)準(zhǔn)的短片段進(jìn)行物種鑒定的新技術(shù)，在中藥基原鑒別、中藥資源生物多樣性的保護(hù)及開發(fā)利用等諸多方面發(fā)揮著重要作用。進(jìn)行DNA條形碼的研究，獲得高質(zhì)量的植物基因組DNA為其先決條件，因此本試驗(yàn)采用不同方法（十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法、改良的CTAB法、十二烷基硫酸鈉（SDS）法及堿裂解法）對(duì)巖陀植物DNA提取結(jié)果進(jìn)行比較研究，以期尋找最佳的DNA提取方法。同時(shí)，該研究結(jié)果也為其它藥用植物在種屬鑒別研究中總DNA提取方法的優(yōu)化選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

實(shí)驗(yàn)所用巖陀植物于2018年7月采自云南省大理蒼山蝴蝶泉，由大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院生藥教研室張德全博士鑒定為羽葉鬼燈檠（Hemsl.），植物標(biāo)本存放于大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院王燕課題組。

1.2 植物基因組總DNA的提取方法

1.2.1 CTAB法[5]

取經(jīng)95%乙醇擦洗干凈的新鮮巖陀植物葉片約100 mg，放置預(yù)冷干凈的研缽中加入10%的PVP-40后加液氮迅速研磨成均勻細(xì)粉。將細(xì)粉轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，加600 μL 60℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液（2%CTAB，100 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/L EDTA，1.4 mol/LNaCl，2%β-巰基乙醇）迅速混勻；將離心管嵌入泡沫浮板放置60 ℃水浴裂解1.5 h，其間上下顛倒數(shù)次，使其裂解均勻；水浴之后取出放至室溫加等體積的氯仿-異戊醇（24:1），輕緩顛倒混勻，室溫下12000 rpm離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中；向離心管中加入1/10體積的10%CTAB溶液（10%CTAB，0.7 mol/L NaCl），重復(fù)上一步操作；將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中加入等體積的沉淀緩沖液（1%CTAB，50mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，1%β-巰基乙醇）緩慢顛倒混勻，室溫放置30 min；沉淀完全后8000 rpm離心10 min，棄上清；沉淀用70%乙醇，無(wú)水乙醇各洗滌1次，8000 rpm離心3 min，棄上清，將離心管倒置潔凈濾紙上，室溫?fù)]干殘留乙醇，加入80 μLTE Buffer溶解即得DNA樣品溶液。

1.2.2 改良CTAB[6]

取經(jīng)95%乙醇擦洗干凈的新鮮巖陀植物葉片約100 mg，放置預(yù)冷干凈的研缽中加入10%的PVP-40后加液氮迅速研磨成均勻細(xì)粉。將細(xì)粉轉(zhuǎn)移至1.5 mL的離心管中，加入65 ℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液600 μL（4%CTAB，100 mmol/L Tris，20 mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl）充分震蕩混勻；將離心管嵌入泡沫浮板放置65℃水浴中裂解2 h，其間上下顛倒數(shù)次，使其裂解均勻；水浴后取出放至室溫加等體積的苯酚-氯仿-異戊醇（25：24:1），輕緩顛倒混勻，12000 rpm離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管中，加入1/10體積4 ℃預(yù)冷的3 mol/L的乙酸鈉，混勻后再加入等體積的4 ℃預(yù)冷的異丙醇，-20 ℃放置30 min以便充分沉淀核酸；沉淀完全后8000 rpm離心5 min，棄上清，加入等體積的2.5 mol/LNaCl溶解沉淀，再加入2 μL的10 mg/mLRnase A去除RNA，緩慢顛倒混勻，37℃水浴保溫5 min；水浴之后加入等體積的氯仿-異戊醇（24:1）萃取8000 rpm離心10 min；轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管中，加入等體積的4 ℃預(yù)冷的異丙醇，-20 ℃放置30 min充分沉淀核酸；8000 rpm離心10 min，棄上清，沉淀用70%的乙醇洗滌2次，將離心管倒置潔凈濾紙上，室溫干燥，80 μLTE Buffer溶解即得DNA樣品溶液。

1.2.3 SDS法[7]

取經(jīng)95 %乙醇擦洗干凈的新鮮巖陀植物葉片約100 mg，放置預(yù)冷干凈的研缽中加入10 %的PVP-40后加液氮迅速研磨成均勻細(xì)粉。將細(xì)粉轉(zhuǎn)移至2 mL預(yù)冷的離心管中，分別加入 800 μL 65 ℃預(yù)熱的SDS提取液（10%SDS，100 mmol/L Tris，50 mmol/L EDTA，0.5 mol/L NaCl），10 μLβ-巰基乙醇和2 μLRNase （10 mg/mL）充分搖勻，將離心管嵌入泡沫浮板放置65 ℃水浴2 h，其間上下顛倒數(shù)次，使其裂解均勻；水浴后取出放至室溫，加入等體積苯酚-氯仿-異戊醇（25:24:1）萃取，12000 rpm離心10 min；取上清液加入等體積氯仿-異戊醇（24︰1），充分混勻，12000 rpm離心10 min；取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入2/3體積4 ℃預(yù)冷的異丙醇，上下顛倒混勻，室溫放置30 min，8000 rpm離心5 min，棄上清，沉淀用70%乙醇洗滌2次，將離心管倒置潔凈濾紙上，室溫干燥，80 μL TE Buffer溶解即得DNA樣品溶液。

1.2.4 堿裂解[8]

取經(jīng)95 %乙醇擦洗干凈的新鮮巖陀植物葉片約100 mg，放置預(yù)冷干凈的研缽中加入10%的PVP-40后加液氮迅速研磨成均勻細(xì)粉，轉(zhuǎn)入預(yù)冷10 mL的離心管中，加入1.0 mL裂解液Ⅰ （20mmol/L Tris-HCl（PH8.0）、10 mmol/L EDTA）充分混勻，加入2 mL裂解液Ⅱ（1% SDS、0.2 mol/L NaOH），充分震蕩混勻，將離心管嵌入泡沫浮板放置65℃水浴中裂解1 h，水浴后取出放至室溫，加入等體積的氯仿-異戊醇（24:1）充分混勻，12000 rpm離心5 min，將上清液分別轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管（1/3V）中，再加入2/3體積的預(yù)冷異丙醇，混勻，室溫放置30 min，12000 rpm離心5 min，棄上清，沉淀用70%乙醇洗滌2次，將離心管倒置潔凈濾紙上，室溫干燥，80 μL TE Buffer溶解即得DNA樣品溶液。

1.3 DNA質(zhì)量檢測(cè)

取10 μL DNA樣品稀釋至50 μL，核酸蛋白檢測(cè)儀讀取其在260、280 nm波長(zhǎng)下的吸光值，根據(jù)A260/A280判斷樣品純度。采用0.8 %的瓊脂糖凝膠，0.5×TBE Buffer，溴化乙錠染色，恒壓（5 V/cm），電泳45 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。通過(guò)DNA電泳條帶分析DNA bp數(shù)及完整性。

1.4 PCR擴(kuò)增檢測(cè)

取1 μL DNA樣品稀釋至10 μL，將稀釋后的DNA溶液取1 μL作為PCR擴(kuò)增模板，ITS2引物序列[9]S2F：5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’；S3R：5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：25 μL（12.5 μL 2×Taq PCR Master Mix（red dye），1 μL模板，正反向引物（10 mmol/L）各1 uL，9.5 μL ddH2O）。PCR反應(yīng)程序：[94℃ 4 min；（35cycles：94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s）；72 ℃ 10 min；4 ℃ ∞]，PCR產(chǎn)物采用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)，0.5×TBE Beffer，溴化乙錠染色，恒壓（4 V/cm），電泳時(shí)間35 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外檢測(cè)

分別采用常規(guī)CTAB法、改良CTAB法、SDS法及堿裂解法對(duì)巖陀葉片總DNA進(jìn)行提取，核酸蛋白紫外檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。改良CTAB法提取的DNA A260/A280值在1.775~1.867，說(shuō)明該方法提取的DNA中RNA、酚類、多糖和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)較少，提取的DNA較為純凈；CTAB法DNAA260/A280值均大于1.9，說(shuō)明該方法提取的DNA中含有RNA。堿裂解和SDS法提取的DNAA260/A280值均小于1.5，說(shuō)明這兩種方法提取的DNA含有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。 CTAB、堿裂解和SDS法提取的DNA濃度普遍偏高，遠(yuǎn)大于改良的CTAB法提取的DNA濃度值，可能的原因?yàn)榇巳N方法提取的DNA中存在RNA、蛋白質(zhì)和糖類等雜質(zhì)，樣品DNA純度受到很大影響。

表1 不同DNA提取方法的巖陀樣品紫外檢測(cè)結(jié)果

2.2 DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

對(duì)常規(guī)CTAB法、改良CTAB法、SDS法和堿裂解法提取的巖陀植物葉片總DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1。以上四種方法提取的巖陀葉片總DNA在15kb附近均有條帶，改良的CTAB法提取的DNA條帶單一明亮，無(wú)拖尾和彌散現(xiàn)象且點(diǎn)樣孔中干凈無(wú)殘留，說(shuō)明改良的CTAB法提取的DNA純度較高；常規(guī)CTAB法提取的DNA同改良過(guò)的CTAB法相比存在RNA污染；SDS法和堿裂解法提取的DNA條帶均有彌散現(xiàn)象，點(diǎn)樣孔中有亮斑，說(shuō)明這兩種方法提取的總DNA中含有多糖或蛋白質(zhì)雜質(zhì)。SDS法較堿裂解法能看到DNA總條帶的存在，而堿裂解法DNA總條帶模糊，不易分辨，在四種DNA提取方法中堿裂解法提取效率最低。

A. 改良CTAB法；B. CTAB法；C. SDS法；D. 堿裂解法

2.3 PCR擴(kuò)增檢測(cè)

對(duì)以上四種不同方法提取的巖陀葉片總DNA進(jìn)行PCP擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖2。以改良CTAB法提取的DNA為模板擴(kuò)增條帶明亮清晰，且擴(kuò)增率達(dá)到100%。以常規(guī)CTAB法提取的DNA為模板雖然也全部擴(kuò)增出來(lái)，與改良CTAB法相比部分條帶較暗，且存在非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象。以SDS法提取的DNA為模板，擴(kuò)增效率偏低且有非特異性擴(kuò)增，會(huì)嚴(yán)重影響下游操作的完成；以堿裂解法提取的DNA為模板擴(kuò)增結(jié)果出現(xiàn)假陰性，條帶彌散更不利于下游操作的完成。綜合紫外檢測(cè)和瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，改良CTAB法更適合巖陀植物葉片總DNA的提取，能夠滿足高質(zhì)量PCR擴(kuò)增的需求。

A . 改良CTAB法 B. CTAB法 C. SDS法 D. 堿裂解法

3 討論

自然界中無(wú)論植物、動(dòng)物還是微生物，大都以DNA作為遺傳物質(zhì)，為了研究不同種屬之間的差異，尋找適宜的DNA提取方法必不可少。目前，研究報(bào)道的三大DNA提取方法包括：沉淀法、磁珠法、離心柱法。沉淀法是DNA提取常用的方法，該方法的關(guān)鍵問(wèn)題是雜質(zhì)的去除。因此，不少專家學(xué)者給出了自己的見(jiàn)解，F(xiàn)ang等[10]認(rèn)為在高鹽TE緩沖液中，用無(wú)水乙醇沉淀DNA能夠有效去除多糖。肖智樣等[11]認(rèn)為CTAB裂解液中適量增加EDTA的用量及異丙醇沉淀過(guò)夜能提高DNA的純度；離心柱法是通過(guò)將對(duì)核酸有吸附作用的活性官能團(tuán)鑲嵌在離心柱上，加入不同的裂解液，洗滌試劑反復(fù)離心，達(dá)到核酸與雜質(zhì)分離的目的。離心柱法提取DNA過(guò)程中需要的樣品量較大，不適宜對(duì)珍稀樣本DNA的提?。淮胖榉╗12]是通過(guò)磁珠表面修飾對(duì)核酸有吸附作用的活性官能團(tuán)，利用磁珠的磁性在外磁場(chǎng)的作用下定向移動(dòng)實(shí)現(xiàn)DNA的富集，從而達(dá)到將核酸與雜質(zhì)分離的目的，該方法操作簡(jiǎn)單，用時(shí)短，安全無(wú)毒，靈敏度高，適用于痕量DNA的提取，但該方法成本較高不適合大量樣本DNA的提取。

本試驗(yàn)對(duì)巖陀DNA提取方法進(jìn)行研究，目的是獲取高質(zhì)量的基因組DNA，對(duì)核糖體ITS/ITS2序列、葉綠體、、等序列能夠成功擴(kuò)增，便于測(cè)序。本實(shí)驗(yàn)在試驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，使用根部細(xì)胞提取的植物基因組DNA無(wú)法成功擴(kuò)增葉綠體、、等序列，初步分析原因是無(wú)法在根部細(xì)胞中提取到葉綠體基因。因此，在巖陀種DNA提取方法研究中選擇該藥材植物葉片作為試驗(yàn)材料較為適合。該試驗(yàn)采用的提取方法是沉淀法中的CTAB法、堿裂解法和SDS法。在用不同方法提取DNA過(guò)程中發(fā)現(xiàn)：SDS法提取的DNA在干燥后呈棕黃色，說(shuō)明提取的DNA樣品中含有酚污染；堿裂解法提取的DNA干燥后呈膠凍狀，說(shuō)明提取的DNA樣品中含有多糖類物質(zhì)，與圖1 SDS法和堿裂解法提取的DNA電泳結(jié)果基本吻合。SDS法、堿裂解法提取的DNA電泳條帶彌散且點(diǎn)樣孔中有亮斑，后續(xù)進(jìn)行的PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物電泳大多較暗，不清晰；而采用改良的CTAB法提取的DNA純度高，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶清晰明亮，擴(kuò)增效率也較高。因此，改良CTAB法可以作為巖陀植物葉片DNA提取方法的最佳選擇。

在植物總DNA提取過(guò)程中，最常出現(xiàn)的問(wèn)題是自身DNA酶的剪切和次生代謝產(chǎn)物的干擾。因此，在植物總DNA提取實(shí)驗(yàn)中需要注意：（1）植物葉片選擇無(wú)病蟲侵害的新鮮葉片，提取前用95%乙醇擦洗葉片表面，吸水紙擦干后再進(jìn)行液氮研磨，既能使酶失活又能防止外源DNA的污染；（2）巖陀葉片中含有酚類、多糖等次生代謝產(chǎn)物，在研磨過(guò)程中適量加入PVP-40（酚類化合物的螯合劑），能有效防止酚類物質(zhì)氧化，防止其與DNA的結(jié)合[13]。對(duì)于多糖的去除辦法，各種文獻(xiàn)報(bào)道不一，原因在于不同植物的DNA提取方法中對(duì)于多糖處理各異，筆者去除多糖采用的是高鹽法，DNA裂解液中NaCl的濃度增加到1.4 mol/L可以有效去除多糖。改良的CTAB法和常規(guī)CTAB法提取的DNA沉淀干燥后呈無(wú)色且在電泳圖一中兩種方法的點(diǎn)樣孔都無(wú)雜質(zhì)殘留，這一現(xiàn)象也證實(shí)多糖已被有效去除。

目前，中藥DNA條形碼研究在中藥鑒別領(lǐng)域處于領(lǐng)先地位，為傳統(tǒng)鑒別方法出現(xiàn)的瓶頸提供新的思路。DNA提取方法也是日新月異，但中藥品種復(fù)雜多樣，同種DNA提取方法很難廣泛應(yīng)用于多種藥用植物。因此，針對(duì)不同植物DNA提取方法的研究很有必要。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)巖陀植物DNA提取方法進(jìn)行了研究，期望能為其它植物的DNA提取提供一定的參考和借鑒意義。

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GENOMIC DNA EXTRACTION METHODS FOR

FANG Qiang-qiang,*WANG Yan

(College of Pharmacology, Dali University, Dali, Yunnan 671000, China)

Fresh leaves ofwere used as experimental materials, the differences of the DNA extraction effects among different methods were compared to find proper DNA extraction methods for meeting the study demands on constructing DNA barcode recognition system ofwith different origins. CTAB method, improved CTAB method, SDS method and alkaline lysis method were used to extract total DNA, the quality of DNA extraction were evaluated by agarose gel electrophoresis, UV spectrophotometry and PCR amplification effect. The results showed that all four methods could extract genomic DNA from the leaves of, DNA purity and integrity in improved CTAB method is significantly higher than that in other methods, in which the PCR amplification efficiency reaches 100%, and the amplified bands are bright and clear. The improved CTAB method can be used as a suitable method for extracting total DNA from the leaves ofand could meet the study demand of DNA barcode.

; DNA extraction; CTAB method; SDS method; alkaline lysis method

Q781

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2019.02.005

1674-8085(2019)02-0019-06

2018-12-20；

2019-01-25

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81560695)；大理大學(xué)博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目(KYBS201512)；大理大學(xué)第八批中青年學(xué)術(shù)帶頭人培養(yǎng)基金項(xiàng)目

方強(qiáng)強(qiáng)(1990-)，男，河南鄭州人，碩士生，主要從事中藥分子鑒定研究(E-mail:1053725723@qq.com);

*王 燕(1982-)，女，云南大理人，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事體內(nèi)藥物分析學(xué)研究(E-mail:175404624@qq.com).