齊燁迪，張詩琪，周鑫悅，陳 莉，林 曉，賴 昕，余麗雙

?

基于納米銀-二氧化鈦-殼聚糖復合物修飾電極的蘆丁電化學傳感器的構建及其應用研究

齊燁迪，張詩琪，周鑫悅，陳 莉，林 曉，賴 昕，*余麗雙

（福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建，福州 350122）

本實驗以Ag-TiO2-CS納米復合物修飾電極構建電化學傳感器，建立適用于其分析檢測的電化學分析新方法。利用Ag-TiO2-CS修飾電極，以此制備蘆丁電化學傳感器。用循環(huán)伏安法（CV）對電極的電化學特性進行研究，之后用差分脈沖伏安法（DPV）對蘆丁進行檢測，建立蘆丁的電化學檢測新方法。CV實驗表明Ag-TiO2-CS納米復合物具有良好的電化學活性，可以應用于蘆丁檢測。DPV實驗進一步表明，修飾電極峰電流值與蘆丁濃度在一定范圍內呈線性關系，穩(wěn)定性、抗干擾性等良好，此電化學傳感器可以對蘆丁片中的蘆丁進行測定，結果良好。該傳感器制作方法簡單，靈敏度較高，穩(wěn)定性好，可用于蘆丁片中蘆丁的分析測定。

蘆??；電化學傳感器；Ag-TiO2-CS納米復合物；修飾電極

蘆?。≧utin），化學名是3’, 4’, 7-三[O- (2-羥乙基) -5羥基黃酮-3]-蕓香苷，又稱為蕓香苷、維生素P，它是從植物中提取出來的天然黃酮類物質，存在于很多傳統(tǒng)中藥以及食物中[1]，例如蕎麥、蘋果和茶，它是食品和植物飲料的重要膳食成分[2-4]。蘆丁具有血管舒張和降低脆性作用，具有抗炎抗菌、抗輻射以及抗氧化作用[5-10]，對心血管、痛風等病也有一定的療效[11]。蘆丁在臨床上主要用于防治高血壓、急性出血性腎炎、腦溢血等疾病[12]。

文獻報道，測定蘆丁原藥材[13-15]的方法主要為高效液相色譜法，測定蘆丁制劑比較常用的方法除了高效液相色譜法(HPLC)[16-18]外，還有熒光分光光度法[19]、紫外-可見分光光度法[20-21]、電泳法[22]、流動注射化學發(fā)光法[23]等。在電化學領域，電化學分析法具有靈敏度高、選擇性好、響應時間短和方法簡便等優(yōu)點，是一種公認的微量和痕量分析方法，在一些苛刻的環(huán)境條件下，也可以進行有效快速的測定[24]。

本實驗進一步探索蘆丁的檢測新方法，以納米材料修飾電極構建電化學傳感器，建立適用于其分析檢測的電化學分析新方法，旨在通過構建電化學傳感器建立蘆丁質量控制的簡便、靈敏、快速的新分析方法，為蘆丁的分析檢測研究、代謝研究提供有效的技術手段。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

CHI660C型電化學工作站（上海辰華儀器有限公司）；舒美KQ116超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；雷磁PHS-3C型精密酸度計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；XS105電子分析天平（Mettler Toledo）； CJJ79-1磁力加熱攪拌器（金壇市白塔新寶儀器廠）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；TGL-16G臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；TECNAI G2F20 場發(fā)射透射電子顯微鏡（美國FEI公司）。

三電極體系：氧化銅/Nafion膜修飾電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極。

1.1.2 試劑

蘆?。ㄖ袊幤飞镏破酚邢薰荆?；復方蘆丁片（上海朝暉藥業(yè)有限公司）；不同pH值不同濃度的磷酸鹽緩沖液、殼聚糖、硼氫化鈉、硝酸銀溶液（國藥集團化學試劑有限公司）。

實驗中所用水均為二次蒸餾水，經(jīng)Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）處理。

1.2 對照品溶液的制備

精密稱取蘆丁對照品適量，用乙醇溶解并制成濃度為1.0 mg/mL的對照品儲備液，檢測時用支持電解質稀釋到一定的濃度。

1.3 Ag-TiO2-CS納米復合物的制備

Ag-TiO2-CS納米復合物參照文獻方法制備[25-26]。取0.5 mL TiO2(5%)、1.0 mL AgNO3(0.05 mo/L)和0.5 mL CS(0.1%)溶液于燒杯中，接著向燒杯中逐滴滴加0.125 mL NaBH4(0.01 mo/L)溶液，直至燒杯中溶液的顏色變成咖啡色，再繼續(xù)攪拌30 min。將制得的Ag-TiO2-CS納米復合物進行離心、洗滌，即得。最后將制得的Ag-TiO2-CS超聲分散于2.0 mL的蒸餾水中，得到均勻的咖啡色懸浮液。

1.4 電化學傳感器的制備

金電極在修飾前，先后用1.0、0.3、0.05 μm的α-Al2O3粉末在專業(yè)拋光布上拋光成鏡面，每次打磨后用蒸餾水清洗干凈。將處理好的電極置于含5 mM K3Fe(CN)6的0.5 M KCl溶液中，采用三電極系統(tǒng)在掃描電壓-1 V~+0.8 V用CV法進行掃描，根據(jù)氧化還原峰電位差判斷電極拋光程度，若符合要求則進行活化。活化用0.5 mol/L的稀硫酸溶液，在掃描電壓0 V~+1.7 V用CV進行掃描，直到峰電流不再增加。

取10 μL Ag-TiO2-CS懸浮液滴涂于預處理好的金電極表面，室溫下自然晾干即制得Ag-TiO2-CS修飾金電極。

1.5 電化學方法

本實驗在 pH值為6.5的0.1 M磷酸氫二鈉-0.1 M磷酸二氫鈉磷酸鹽緩沖溶液為支持電解質的條件下，采用三電極系統(tǒng)，用差分脈沖伏安法對蘆丁在修飾電極上的電化學行為進行研究并對其進行定量測定。

2 實驗結果與分析討論

2.1 Ag-TiO2-CS納米復合物的表征

Ag-TiO2-CS納米復合物透射電鏡（TEM）表征結果如圖1所示，所用二氧化鈦為準八面體構型，由電鏡圖可以看出，銀離子成功復合到二氧化鈦納米材料表面，且比較均勻存在。

圖1 Ag-TiO2-CS納米復合物透射電鏡圖

2.2 傳感器的電化學行為

分別用裸電極和Ag-TiO2-CS修飾電極作為工作電極，在緩沖溶液和蘆丁溶液中，在-0.6 V~+0.6 V電位范圍內進行CV掃描。圖2中曲線a是裸電極在含0.1 mM的蘆丁的0.1 M PBS（pH = 6.5）緩沖溶液中的CV圖，曲線b是Ag-TiO2-CS修飾電極在含0.1 mM的蘆丁的0.1 M PBS（pH = 6.5）緩沖溶液中的CV圖，曲線c是Ag-TiO2-CS修飾電極在0.1 M PBS（pH = 6.5）緩沖溶液中的CV圖。從圖2可以看出，蘆丁在裸電極上沒有氧化還原峰（曲線a），Ag-TiO2-CS修飾電極在0.1 M PBS中出現(xiàn)一對氧化還原峰（曲線c），說明Ag-TiO2-CS具有較好的電化學活性，其活性來自零價Ag和一價Ag之間發(fā)生的反應。當加入蘆丁對照品之后，修飾電極的氧化還原峰增大（曲線b），說明蘆丁與Ag-TiO2-CS修飾電極之間有較強的電催化作用。

(a)裸金電極，0.1 MPBS+0.1mM蘆丁；（b）Ag-TiO2-CS修飾電極，0.1 MPBS+0.1 mM蘆?。唬╟）Ag-TiO2-CS修飾電極，0.1 MPBS

2.3 電化學檢測條件優(yōu)化

2.3.1 電極修飾液用量

本實驗對電極修飾液的用量進行考察，檢測不同用量對蘆丁測定的影響。結果如圖3所示，峰電流值一開始隨著修飾液用量的增加而增加，當修飾液用量為8 μL時，峰電流值達到最大。修飾液用量繼續(xù)增加，峰電流值反而下降，因此最優(yōu)電極修飾液用量為8 μL。

圖3 電極修飾液用量考察

2.3.2 支持電解質pH的優(yōu)化

實驗通過對蘆丁在不同pH的0.1 M PBS中的CV行為進行考察，以此來對支持電解質的pH進行優(yōu)化，實驗結果如圖4所示。當pH為6.5時，峰電流值達到最大，因此選擇6.5作為最優(yōu)支持電解質pH值。

圖4 pH值考察

2.3.3 儀器參數(shù)的優(yōu)化

實驗考察了掃描速率對蘆丁電化學測定的影響，綜合考慮峰型、峰值等因素，選擇最優(yōu)的掃描速率是100 mV/s。

2.4 電化學傳感器的性能

在pH值為6.5，其他實驗條件為最佳條件下，對蘆丁電化學傳感器的性能進行分析。在傳感器的掃描范圍為-0.6~0.6 V，支持液為0.1 M的PBS中進行DPV檢測。

隨著蘆丁濃度的增加，蘆丁和修飾電極的結合量增加，進而使催化效果升高，最終使得電化學傳感器的DPV檢測信號增加。經(jīng)過對電化學傳感器在不同蘆丁濃度下的DPV分析，并對不同濃度的蘆丁的DPV電流峰值進行線性擬合（圖5）即y = 0.5395x+0.7099，得到電化學傳感器線性檢測范圍為0.5~100 μM，檢測限為0.1 μM，線性相關性為2= 0.9939。結果表明該電化學傳感器線性范圍較好、檢測限較低。

圖5 峰電流值與蘆丁的線性曲線

2.5 電化學傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

平行制備6根電極，在完全相同的體系下對同一份蘆丁對照品溶液進行電化學檢測，測得RSD為2.13% ，可見修飾膜可以穩(wěn)定并且均勻地存在于金電極表面，所構建的電化學傳感器的重現(xiàn)性良好。

將所構建的Ag-TiO2-CS蘆丁電化學傳感器懸掛在0.1 MPBS中，于4℃溫度條件下分別放置一天、一周后，對同一蘆丁對照品溶液進行測定，放置一天以及一周后測得的峰電流值分別為最初的95.23%，93.3%，所以可得此蘆丁電化學傳感器的穩(wěn)定性良好。

2.6 實際樣品的測定

為了檢驗Ag-TiO2-CS修飾金電極是否可以用于蘆丁片中蘆丁的含量測定，在最優(yōu)的實驗條件下，平行制備了6份供試品溶液進行檢測，實驗測得其平均含量為標示量的96.60%，相當于含蘆丁19.32 mg/片，RSD為4.96%，測定結果如表1所示。

表1 實際樣品的測定

2.7 干擾實驗

本實驗對蘆丁片中常見的填充劑淀粉、崩解劑干淀粉、潤滑劑硬脂酸鎂等進行考察，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)片劑中常用的輔料對蘆丁片的測定均無干擾。

3 小結

本實驗通過制備Ag-TiO2-CS納米復合物并將其固載在金電極表面，制得電化學免疫傳感器。Ag-TiO2-CS復合物疏松、均質且具有良好的電化學活性，有利于電子的運輸，其制作簡便且穩(wěn)定性好。本實驗通過對Ag-TiO2-CS納米復合物的用量、檢測體系的pH值、儀器參數(shù)等條件進行優(yōu)化后，得到最佳的實驗條件。在最優(yōu)的實驗條件下進行電化學傳感器的抗干擾性、穩(wěn)定性等考察，結果表明所構建的電化學傳感器經(jīng)過良好表征和優(yōu)化后具有良好的分析性能，如線性檢測范圍寬、檢測限低、靈敏度高，且重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性好，同時所建立的新方法可用于測量蘆丁片中的蘆丁含量，檢測結果滿意。

[1] 王斌,趙明,陳志勇,等. 蘆丁對單側輸尿管梗阻大鼠腎間質纖維化的作用研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2018,29(8): 1796-1800.

[2] Kreft S, Knapp M, Kreft I. Extraction of rutin from buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) seeds and determination by capillary electrophoresis[J].Agric Food Chem,1999, 47:4649–4652.

[3] Kuntic′ V, Pejic′ N, Ivkovic′ B, et al. Isocratic RP-HPLC method for rutin determination in solid oral dosage forms[J]. Pharm Biomed Anal ,2007,43:718–721.

[4] Gulpinar A R, Orhan I E, Kan A, et al. Estimation of in vitro neuroprotective properties and quantification of rutin and fatty acids in buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) cultivated in Turkey[J]. Food Res Int,2012, 46:536–543.

[5] 石生益,梁晶晶,楊明. 苦蕎麥中蘆丁的正交提取工藝及HPLC檢測研究[J].中國釀造,2010,29(11):162-164.

[6] Samsonowicz M, Kaminska I, Kalinowska M, et al. Alkali metal salts of rutin - Synthesis, spectroscopic (FT-IR,FT-Raman,UV-VIS),antioxidant and antimicrobial studies[J].Spectrochim Acta A, 2015, 151:926-938.

[7] Pes T S, Sacco EMH, Ourique G M, et al. Effect of diets enriched with rutin on blood parameters, oxidative biomarkers and pituitary hormone expression in silver catfish (Rhamdia quelen)[J]. Fish Physiol Biochem, 2016, 42: 321-333.

[8] 王斯慧,黃琬凌,陳慶松,等. 蘆丁、槲皮素對α- 葡萄糖苷酶活性抑制研究[J].中國釀造, 2012, 31(1): 133-135.

[9] 賈娜,王樂田,邵俊花,等.蘆丁對冷藏豬肉糜脂肪和蛋白氧化及品質特性的影響[J].食品與發(fā)酵工業(yè), 2016, 42(10): 105-111.

[10] 翟巍,鄭賽飛,王素紅,等. 蘆丁鍺的抗氧化能力觀察[J].鄭州大學學報:醫(yī)學版, 2013, 48(1): 115-117.

[11] 馬溶,龐廣昌. 蘆丁對現(xiàn)代文明病的作用[J].食品科學, 2013, 34(7):307-311.

[12] 魏江存,陳勇,闕祖亮,等. 優(yōu)化槐米中蘆丁提取工藝的實驗研究[J].井岡山大學學報:自然科學版,2017,38(2): 91-95,101.

[13] 王信,李彩東,潘新波,等. HPLC法同時測定珠子草中沒食子酸、短葉蘇木酚、柯里拉京、鞣花酸和蘆丁的含量[J].藥物分析雜志,2018,38(9):1641-1645.

[14] 程聰梅,毛菊華,余樂. HPLC 法同時測定桑葉藥材及其炮制品中綠原酸、蘆丁和異槲皮苷的含量[J]. 中國藥房, 2016, 27 (21):2990-2992.

[15] 周靜,美麗萬,阿不都熱依木. HPLC 法測定維藥刺山柑種子中沒食子酸和蘆丁的含量[J].西北藥學雜志, 2014, 29(2): 117-119.

[16] 鄭宓. 高效液相色譜法測定復方蘆丁片中維生素C 的含量[J].海峽藥學, 2014, 26(4): 66-68.

[17] 孫銀華. 雙波長高效液相色譜法測定復方蘆丁片中維生素C 和蘆丁的含量[J].安徽醫(yī)藥, 2012, 16(1): 30-32.

[18] 馬君義,張串瞎,趙保堂. RP-HPLC 法測定不同廠家蘆丁片和復方蘆丁片中蘆丁的含量[J].西北師范大學學報,:自然科學版, 2010, 46(5): 74-81.

[19] 于沙蔚,程偉青,潘愛萍. L-Cys-CdS 納米熒光探針熒光猝滅法測定蘆丁含量[J].化學研究與應用, 2014, 26(8): 1291-1294.

[20] 曾華金,梁會麗,游靜,等. 偏最小二乘法結合流動注射化學發(fā)光法同時測定蘆丁和維生素C[J].發(fā)光學報, 2013, 34(3): 369-374.

[21] 楊贅. 分光光度法測定復方刺五加片中總黃酮含量研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生, 2012, 50(7): 90-91.

[22] 韋湫陽,朱平川,薛瑩,等. 膠束毛細管電泳法同時測定消栓通絡片中5 種有效成分[J]. 分析測試學報, 2012, 31(8): 992-995.

[23] 朱琳,任清木,徐笑穎.高速逆流色譜分離純化苦蕎中蘆丁、槲皮素[J].食品科學, 2014, 35(2): 47-50.

[24] 徐苗青. 電化學分析實驗研究綜述報告[J].化工管理,2013(6):147-149.

[25] Paddon C A, Marken F. Hemoglobin adsorption into TiO2phytate multi-layer films: particle size and conductivity effects[J]. Electrochem Commun, 2004(6): 1249-1253.

[26] Tan L,Chen Y Q, Yang H, et al. Alpha-l-fetoprotein antibody functionalized Au nanoparticles: catalytic labels for the electrochemical detection of α-l-fetoprotein based on TiO2nanoparticles synthesized with ionic liquid[J]. Sensor Actuat B-Chem, 2009, 142: 316-320.

Construction and Application of Rutin Electrochemical Sensor Based on Nano-silver-TiO2-Chitosan Complex Modified Electrode

QI Ye-di, ZHANG Shi-qi, ZHOU Xin-yue, CHEN Li, LIN Xiao, LAI Xin,*YU Li-shuang

(College of pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou, Fujian 350122, China)

In this experiment, an electrochemical sensor was constructed by using Ag-TiO2-CS nanocomposite modified electrode to establish a new method of electrochemical analysis suitable for the analyzing and detecting rutin wihich is a flavonoid extracted from plants and has anti-inflammatory, anti-radiation and anti-oxidation effects. The rutin electrochemical sensor was prepared by modifying the electrode with Ag-TiO2-CS. The electrochemical characteristics of the electrode were studied by cyclic voltammetry (CV), the rutin was detected by differential pulse voltammetry (DPV) to establish a new electrochemical detection method for rutin. CV experiments showed that Ag-TiO2-CS nanocomposites had good electrochemical activity and could be applied in rutin detection. DPV experiments further showed that the peak current values of the modified electrode were linear with the rutin concentration within a certain range. The electrochemical sensor with good stability and anti-interference can measure the rutin in the rutin tablet, and the result is good. The sensor has simple preparation method, high sensitivity and good stability, and can be used for the analysis and determination of rutin in rutin tablets.

rutin; electrochemical sensor; Ag-TiO2-CS nanocomposite; modified electrode

R917

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2019.02.003

1674-8085(2019)02-0010-05

2018-12-11；

2019-01-02

福建省科技廳計劃項目（2017Y0051，2018J01871）；福建省教育廳計劃項目（JZ160445，JAT170288）；福建中醫(yī)藥大學校管課題重點專項（X2017012-重點）

齊燁迪(1992-)，女，河北石家莊人，碩士生，主要從事中藥分析方法學研究(E-mail:1175056354@qq.com);

張詩琪(1994-)，女，吉林長春人，碩士生，主要從事中藥分析方法學研究(E-mail:729329177@qq.com);

周鑫悅(1995-)，女，重慶人，碩士生，主要從事中藥分析方法學研究(E-mail:604108084@qq.com);

陳 莉(1980-)，女，福建福州人，副教授，主要從事中藥質量控制研究(E-mail:shirly_chli2018@163.com);

林 曉(1985-)，女，福建福州人，講師，主要從事中藥質量控制研究(E-mail:15031815@qq.com);

賴 昕(1987-)，女，福建福州人，講師，主要從事中藥質量控制研究(E-mail:117802843@qq.com);

*余麗雙(1982-)，女，福建莆田人，副研究員，博士，碩士生導師，主要從事中藥分析方法學研究(E-mail:sly2018@126.com).