趙 艷，汪 成

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江杭州 310018）

以小球藻為代表的微藻是一類能進(jìn)行光合自養(yǎng)生長(zhǎng)的單細(xì)胞綠藻，易于培養(yǎng)且生長(zhǎng)迅速，富含蛋白、油脂、維生素、礦物質(zhì)及多種生理活性成分，在醫(yī)藥、食品、飼料和生物柴油新能源方面的應(yīng)用潛力巨大[1-2]。2011年，我國(guó)“神舟8號(hào)”搭載小球藻上天進(jìn)行生態(tài)循環(huán)科學(xué)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)小球藻能提供氧氣，并作為食物來(lái)源確保宇航員在空間站的全面營(yíng)養(yǎng)，而且還可能對(duì)很多醫(yī)學(xué)難題提供重要的解決方案[3]。特別是蛋白核小球藻 (Chlorella pyrenoidosa)具有蛋白含量高，富含各種必需氨基酸和多種營(yíng)養(yǎng)保健因子，2012年被我國(guó)增列為新資源食品[4]，其研究開(kāi)發(fā)很快成為熱點(diǎn)。微藻的大規(guī)模培養(yǎng)是實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的前提。人工培養(yǎng)技術(shù)中比基因工程或代謝工程手段更簡(jiǎn)單有效的策略是通過(guò)改變培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件影響藻細(xì)胞代謝途徑，以達(dá)到提高油脂、多糖等目標(biāo)化合物生產(chǎn)率的目的[5]。氮是蛋白質(zhì)、核酸、磷脂和葉綠素等物質(zhì)合成的基本元素，在新陳代謝中至關(guān)重要。研究表明，降低培養(yǎng)基中的氮素供應(yīng)使藻細(xì)胞處于低氮脅迫狀態(tài)能影響藻細(xì)胞光合效率、生物量與生化組分合成[6]。低氮脅迫作為提高微藻生產(chǎn)效益的低成本技術(shù)，增效作用在不同藻種之間差異很大[7]，這是因?yàn)樵宸N不同細(xì)胞氮代謝途徑和整體代謝網(wǎng)絡(luò)模式不同，對(duì)低氮脅迫信號(hào)的響應(yīng)機(jī)制也不一致。只有針對(duì)不同藻種研究低氮脅迫的適宜水平和收獲時(shí)間等因素才能使收益最大化。代瑞華等[8]報(bào)道適宜的低氮脅迫處理會(huì)促進(jìn)銅綠微囊藻細(xì)胞分裂，縮短生長(zhǎng)周期。吳桂秀等[9]發(fā)現(xiàn)低氮脅迫有利于大真眼點(diǎn)藻和波氏真眼點(diǎn)藻的總脂和中性脂的積累。Adams等[6]研究了低氮脅迫對(duì)6種微藻生長(zhǎng)與油脂累積的影響，發(fā)現(xiàn)普通小球藻經(jīng)4 mmol/L低氮脅迫培養(yǎng)12天后，其生物量比對(duì)照減少了51%，但藻細(xì)胞油脂含量增加了302%。Gong等[10]研究了低氮脅迫對(duì)4株海洋微藻油脂含量的影響，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)5天后角毛藻、三角褐指藻和綠色巴夫藻細(xì)胞內(nèi)總脂肪酸含量已增加了一倍，眼點(diǎn)擬微綠球藻總脂肪酸含量卻增長(zhǎng)不明顯。此外，微藻作為一個(gè)代謝整體，在氮脅迫下生長(zhǎng)和生化組分的合成變化密切相關(guān)。如球等鞭金藻 (Isochrysis galbana) 當(dāng)細(xì)胞內(nèi)源型儲(chǔ)存氮達(dá)到最低閾值時(shí)，藻細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢同時(shí)細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)和類胡蘿卜素開(kāi)始大量積累[11]。微擬球藻在氮源不足時(shí)，細(xì)胞蛋白與氨基酸含量顯著下降，碳代謝流向碳水化合物或者脂質(zhì)從而提高糖類或油脂積累量[12]。萊茵衣藻在低氮脅迫條件下，淀粉含量和油脂合成之間存在著競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系[13]。國(guó)內(nèi)外對(duì)低氮脅迫下微藻的代謝研究鮮見(jiàn)涉及蛋白核小球藻藻種，報(bào)道多集中于微藻生長(zhǎng)和胞內(nèi)生化組分方面，尚缺乏自養(yǎng)和葡萄糖兼養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)方式來(lái)源的藻細(xì)胞對(duì)低氮脅迫響應(yīng)的系統(tǒng)比較，而且對(duì)胞外聚合物質(zhì) (extracellular polymeric substances，EPS) 研究極少。葡萄糖不僅是細(xì)胞的主要能量來(lái)源，還可以作為信號(hào)觸發(fā)特定的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路控制細(xì)胞代謝狀態(tài)[14]，葡萄糖兼養(yǎng)藻細(xì)胞對(duì)低氮脅迫處理的生化反應(yīng)是否與自養(yǎng)藻細(xì)胞存在差異值得探究。微藻EPS主要為多糖、蛋白質(zhì)等代謝產(chǎn)物，積累在細(xì)胞表面，通過(guò)穩(wěn)定的膜結(jié)構(gòu)來(lái)保護(hù)細(xì)胞，與藻細(xì)胞絮凝性能密切相關(guān)，并且在營(yíng)養(yǎng)缺失時(shí)能為細(xì)胞提供碳與能量供應(yīng)[15]。由此推測(cè)培養(yǎng)條件的改變可能通過(guò)影響EPS組成進(jìn)而影響細(xì)胞絮凝收獲性能。由于微藻細(xì)胞尺寸小，當(dāng)前普遍采用的離心沉降等物理收獲方法成本約占微藻生產(chǎn)總成本的三分之一，嚴(yán)重限制了其生產(chǎn)應(yīng)用[16]，因此研究低氮脅迫對(duì)藻細(xì)胞EPS組分及絮凝性能的影響具有重要現(xiàn)實(shí)意義。系統(tǒng)比較研究自養(yǎng)和兼養(yǎng)來(lái)源的蛋白核小球藻在生長(zhǎng)速率、油脂含量、胞內(nèi)外蛋白和淀粉等生化組分對(duì)低氮脅迫處理的響應(yīng)差異，從EPS組分變化角度初步探究低氮脅迫處理對(duì)藻細(xì)胞絮凝性能的影響和相關(guān)機(jī)制，為蛋白核小球藻的人工培養(yǎng)技術(shù)優(yōu)化提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

蛋白核小球藻藻種購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所，藻種編號(hào)為FACHB-1222。

1.2 主要儀器與試劑來(lái)源

電熱鼓風(fēng)干燥箱101-3購(gòu)自上海申光制造儀器公司；智能人工氣候箱safe PRX-600B購(gòu)自寧波賽福實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；臺(tái)式冷凍恒溫振蕩器THZ-C-1購(gòu)自蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；電熱恒溫水浴鍋XMTD-8222購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；臺(tái)式高速離心機(jī)H1650購(gòu)自湘儀儀器有限公司；超速冷凍離心機(jī)Centrifuge 5417R購(gòu)自北京伯樂(lè)有限公司；顯微鏡BM1000購(gòu)自江南永新；熒光光度計(jì)HitachiF-7000型購(gòu)自日立高新技術(shù)公司。葡萄糖、NaNO3等生化試劑購(gòu)自上海生工公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 小球藻的培養(yǎng)和生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定 以BG11培養(yǎng)基[17]為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，挑取單藻落純化后接入BG11培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期作為種子細(xì)胞，分別接入BG11自養(yǎng)培養(yǎng)基和添加10 g/L葡萄糖的BG11兼養(yǎng)培養(yǎng)基，接種初始濃度均為2 × 106cell/mL。待培養(yǎng)至穩(wěn)定期，收獲藻細(xì)胞接種到低氮培養(yǎng)基，藻細(xì)胞接種后初始濃度均為1 × 107cell/mL。培養(yǎng)條件為25℃，光強(qiáng)2000 Lux，光周期中光暗比L∶D為12 h∶12 h，每天早晚各搖動(dòng)一次。每組設(shè)置3個(gè)平行，自養(yǎng)和兼養(yǎng)來(lái)源藻細(xì)胞的培養(yǎng)周期均為5 d。BG11基本培養(yǎng)基氮素為18 mmol/L硝酸鈉 (1N)，作為對(duì)照；以添加3種不同初始濃度 (3、6、9 mmol/L氮濃度，即，1/6N、1/3N、1/2N) 的硝酸鈉作為低氮脅迫處理培養(yǎng)基。

接種培養(yǎng)后每天取樣一次，取樣時(shí)間為光照10 h后，離心收集適量藻細(xì)胞并烘干至恒重，計(jì)算干重生物量。

1.3.2 藻細(xì)胞油脂提取和含量的測(cè)定 采用溶劑提取法和脂染色法對(duì)蛋白核小球藻油脂含量進(jìn)行測(cè)定，并建立油脂含量與脂染色后在645 nm吸光度(A) 的線性回歸方程，采用脂染色法測(cè)定培養(yǎng)過(guò)程中的油脂。溶劑提取法操作參考Zhao等[18]的方法，脂染色法具體操作參照任潔等[19]的方法。油脂產(chǎn)率按照如下公式計(jì)算：

藻細(xì)胞油脂產(chǎn)率[mg/(L·d)] = 收獲藻細(xì)胞干重(mg/L) × 油脂含量/培養(yǎng)天數(shù) (d)

1.3.3 小球藻胞內(nèi)蛋白的提取和測(cè)定 在PBS緩沖液中冰浴條件下以超聲波破碎藻細(xì)胞后，用0.1 mol/L的NaOH振蕩提取2 h，8000 r/min離心15 min，收集上清，即為總蛋白。采用Bradford法[20]以牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定蛋白濃度，換算出每克干重藻細(xì)胞總蛋白質(zhì)含量?？偟鞍缀繙p去藻細(xì)胞EPS中蛋白含量即為胞內(nèi)蛋白含量。

總蛋白含量 (mg/g，藻細(xì)胞干重) = 蛋白濃度(mg/mL) × 提取液體積 (mL)/藻細(xì)胞干重 (g)

1.3.4 小球藻胞內(nèi)淀粉的提取和測(cè)定 參照徐嬪等[21]的方法，以淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中淀粉含量。藻細(xì)胞總淀粉含量減去胞外聚合物 (EPS) 中淀粉含量即為胞內(nèi)淀粉含量。

1.3.5 小球藻胞外產(chǎn)物EPS的提取與分析 小球藻EPS的提取與分析參照Yang等[22]的方法。培養(yǎng)結(jié)束后，取藻細(xì)胞干重相當(dāng)于0.1 g的微藻懸浮液，8 000 r/min離心10 min，棄上清，用5 mL去離子水洗滌沉淀，8 000 r/min離心5 min，微藻沉淀用5 mL去離子水懸浮并加熱至80℃，水浴30 min。隨后以8 000 r/min離心10 min，得上清液用0.45 μm醋酸纖維素膜過(guò)濾，濾液即EPS組分。按如1.3.4所述測(cè)定EPS組分中的胞外蛋白質(zhì)含量和以淀粉含量表征的胞外多糖含量。

小球藻EPS三維熒光光譜 (3D-EEM) 的測(cè)定條件參照Lv等[23]的方法。使用150 W氙弧燈為激發(fā)光源，光電倍增管 (PMT) 電壓為700 V；設(shè)定激發(fā)狹縫寬度為10 nm，發(fā)射狹縫寬度為1 nm。光譜儀掃描范圍為激發(fā)波長(zhǎng)/發(fā)射波長(zhǎng) (EX/EM) = 200～450 nm/250～550 nm，掃描速度為1200 nm/min。得到每個(gè)EX/EM所對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度 (Intensity，單位為arbitary units，a.u.)，對(duì)所有數(shù)據(jù)點(diǎn)采用Origin9.0軟件進(jìn)行處理，形成等高線熒光光譜圖。

1.3.6 藻細(xì)胞絮凝率測(cè)定 參照Alam等[24]的方法并稍作修改。測(cè)定時(shí)搖動(dòng)培養(yǎng)液以使藻細(xì)胞分散均勻，然后將10 mL細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到試管中搖勻并測(cè)定藻細(xì)胞總濃度A (cell/mL)，將培養(yǎng)液靜置12 h后，在距離液面頂部4 cm處取細(xì)胞懸液試樣，測(cè)量試樣藻細(xì)胞濃度B (cell/mL)。絮凝率按照如下公式計(jì)算：

絮凝率 (flocculating ability) = (A-B)/A × 100%

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)試驗(yàn)處理設(shè)3次重復(fù)，各指標(biāo)測(cè)定結(jié)果以“平均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，應(yīng)用SPSS22.0軟件對(duì)對(duì)照和各處理組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，P＜ 0.05為差異顯著，P＜ 0.01為差異極顯著。采集數(shù)據(jù)利用Origin 9.0軟件進(jìn)行分析作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖兼養(yǎng)培養(yǎng)對(duì)蛋白核小球藻生長(zhǎng)和油脂積累的影響

表1顯示，自養(yǎng)與兼養(yǎng)的蛋白核小球藻分別在培養(yǎng)15 d和10 d時(shí)生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期，此時(shí)兼養(yǎng)組的藻細(xì)胞干重生物量、油脂含量同比是自養(yǎng)組的1.62～2.82倍，油脂產(chǎn)率達(dá)到自養(yǎng)組的7.60倍?？梢?jiàn)葡萄糖兼養(yǎng)培養(yǎng)使藻細(xì)胞生長(zhǎng)周期縮短，產(chǎn)油效益大幅度提升。

2.2 低氮脅迫對(duì)不同來(lái)源蛋白核小球藻生長(zhǎng)和油脂積累的影響

不同濃度低氮脅迫處理，自養(yǎng)和兼養(yǎng)來(lái)源的蛋白核小球藻生長(zhǎng)和油脂積累如圖1所示。自養(yǎng)和兼養(yǎng)來(lái)源的蛋白核小球藻均在1/3N培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最快，4 d后進(jìn)入穩(wěn)定期，藻細(xì)胞干重分別達(dá)到2.56 g/L和4.62 g/L，分別為對(duì)照組 (1N) 的1.13倍和1.18倍，差異顯著。

表 1 自養(yǎng)與兼養(yǎng)培養(yǎng)對(duì)蛋白核小球藻生長(zhǎng)和油脂積累的影響Table 1 The effect on growth and lipid accumulation of Chlorella pyrenoidosa of autotrophic and mixotrophic culture

圖 1 不同濃度低氮脅迫下蛋白核小球藻干重和油脂含量Fig. 1 Dry biomass and lipid contents of Chlorella pyrenoidosa under low N stresses

隨著低氮脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，自養(yǎng)和兼養(yǎng)來(lái)源的藻細(xì)胞油脂含量變化趨勢(shì)相似，1/2N和1N處理組藻細(xì)胞油脂含量下降后回升不明顯，1/6N和1/3N低氮脅迫的藻細(xì)胞油脂含量先下降后回升，具有明顯的拐點(diǎn)現(xiàn)象 (圖1)，其中1/3N處理組油脂含量顯著高于其它組，可見(jiàn)1/3N低氮脅迫最能激發(fā)細(xì)胞的油脂合成。自養(yǎng)和兼養(yǎng)藻細(xì)胞油脂含量回升拐點(diǎn)分別出現(xiàn)在2 d和3 d，說(shuō)明兼養(yǎng)來(lái)源的藻細(xì)胞對(duì)低氮脅迫響應(yīng)較慢。培養(yǎng)至5 d時(shí)，1/3N處理的自養(yǎng)組藻細(xì)胞油脂含量為17.19%，與種子藻細(xì)胞初始值相當(dāng)，但兼養(yǎng)組藻細(xì)胞油脂含量仍顯著低于其種子細(xì)胞初始值。

綜合藻細(xì)胞干重與油脂含量?jī)蓚€(gè)指標(biāo)計(jì)算油脂產(chǎn)率，自養(yǎng)與兼養(yǎng)組的蛋白核小球藻均是在1/3N低氮培養(yǎng)基中油脂產(chǎn)率最大，4 d油脂產(chǎn)率分別達(dá)到峰值 16.30 mg/(L·d) 和 129.56 mg/(L·d)，同比 1N 對(duì)照組增幅分別為12.65%和35.82%，均顯著高于處理前藻細(xì)胞?？梢?jiàn)，自養(yǎng)組藻細(xì)胞雖然對(duì)低氮脅迫的響應(yīng)較敏感，但低氮脅迫對(duì)兼養(yǎng)組藻細(xì)胞油脂產(chǎn)率的提升效果更顯著。

2.3 低氮脅迫對(duì)不同來(lái)源蛋白核小球藻胞內(nèi)蛋白和淀粉含量的影響

為了研究低氮脅迫處理對(duì)小球藻細(xì)胞的油脂合成與胞內(nèi)其他生化組分的相關(guān)性，以1N組為對(duì)照，比較分析了1/3N低氮脅迫處理 (簡(jiǎn)稱低氮組) 對(duì)自養(yǎng)和兼養(yǎng)來(lái)源的蛋白核小球藻胞內(nèi)蛋白和淀粉含量的影響 (圖 2)。

自養(yǎng)和兼養(yǎng)來(lái)源的藻細(xì)胞胞內(nèi)蛋白初始含量不同，兼養(yǎng)組藻細(xì)胞胞內(nèi)初始蛋白含量 (152.07 mg/g)比自養(yǎng)組藻細(xì)胞高53.9%。轉(zhuǎn)接后第1天兼養(yǎng)組藻細(xì)胞胞內(nèi)蛋白含量下降幅度均超過(guò)20.0%，高于自養(yǎng)組藻細(xì)胞的下降幅度 (8.0%以下)。自養(yǎng)組藻細(xì)胞胞內(nèi)蛋白含量在4天內(nèi)均逐日下降，只是低氮組每天降幅 (8.0%～10.0%) 高于對(duì)照組 (3.0%～6.0%)，且最大降幅出現(xiàn)第3天，比對(duì)照組 (第2天) 晚。兼養(yǎng)組藻細(xì)胞對(duì)低氮脅迫處理的反應(yīng)有所不同，1N對(duì)照組前3天胞內(nèi)蛋白含量持續(xù)下降至谷值99.22 mg/g，第4天顯著回升至132.17 mg/g?？梢?jiàn)在氮素供應(yīng)充足(1N) 時(shí)，儲(chǔ)能相對(duì)豐富的兼養(yǎng)組藻細(xì)胞在轉(zhuǎn)接入新鮮培養(yǎng)基渡過(guò)適應(yīng)性初期后，胞內(nèi)蛋白即開(kāi)始合成積累。相比而言，接入1/3N低氮培養(yǎng)基的兼養(yǎng)組藻細(xì)胞胞內(nèi)蛋白含量呈持續(xù)下降趨勢(shì)。

自養(yǎng)組藻細(xì)胞胞內(nèi)淀粉含量在轉(zhuǎn)接后先下降后上升，均于第3天達(dá)到谷值，與對(duì)照組相比，低氮組胞內(nèi)淀粉含量降幅較大，第4天升幅更小。兼養(yǎng)來(lái)源的藻細(xì)胞胞內(nèi)淀粉含量于轉(zhuǎn)接后第1天顯著下降，第2～3天維持在相對(duì)低值，之后明顯回升，4天時(shí)低氮組藻細(xì)胞胞內(nèi)淀粉含量回升幅度也顯著低于對(duì)照組。

圖 2 培養(yǎng)基供氮水平1 N和1/3 N時(shí)蛋白核小球藻胞內(nèi)蛋白和淀粉含量變化Fig. 2 Change incontents of intracellular proteins and starch of Chlorella pyrenoidosa grown in media with nitrogen supply levels of 1 N and 1/3 N

2.4 低氮脅迫對(duì)不同來(lái)源蛋白核小球藻胞外蛋白和多糖含量的影響

圖3表明，兼養(yǎng)組藻細(xì)胞EPS中蛋白含量顯著高于自養(yǎng)組，所有藻細(xì)胞轉(zhuǎn)接后EPS中蛋白含量均低于種子細(xì)胞的初始值。自養(yǎng)藻細(xì)胞對(duì)照組胞外蛋白含量持續(xù)下降，低氮組則前2天逐漸降至最低值2.69 mg/g，之后有所回升。兼養(yǎng)藻細(xì)胞EPS中蛋白含量均持續(xù)降低，低氮組同比對(duì)照組降幅更大，4天時(shí)低氮組藻細(xì)胞EPS蛋白含量比對(duì)照組低33.2%。

所有試驗(yàn)組藻細(xì)胞EPS中多糖含量變化趨勢(shì)一致，均隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低。兼養(yǎng)組藻細(xì)胞胞外多糖含量同比高于自養(yǎng)組，低氮組同比低于對(duì)照組。4天時(shí)兼養(yǎng)低氮組藻細(xì)胞EPS中多糖含量比對(duì)照組下降37.7%。

2.5 低氮脅迫對(duì)不同來(lái)源蛋白核小球藻EPS組分和絮凝性能的影響

2.5.1 對(duì)藻細(xì)胞EPS組分的影響 以1/3N低氮脅迫處理第4天的藻細(xì)胞為例，采用三維熒光掃描進(jìn)一步比較了低氮脅迫處理對(duì)自養(yǎng)和兼養(yǎng)來(lái)源的藻細(xì)胞EPS組分的影響 (圖4)。自養(yǎng)與兼養(yǎng)組種子藻細(xì)胞EPS熒光掃描圖譜均在T、A和C區(qū)各存在一個(gè)主峰 (圖4A、B)，分別代表不同類型的熒光基團(tuán)。Chen等[25]對(duì)各峰的生化組分進(jìn)行圖譜解析可知，T峰 (Ex/Em：280/352 nm) 為蛋白樣類色氨酸物質(zhì)；A峰 (Ex/Em：230/373 nm) 是以富里酸為代表的類腐殖酸物質(zhì)；C峰 (Ex/Em：330/373 nm) 是以胡敏酸為代表的類腐殖酸物質(zhì)。T峰代表的蛋白樣類色氨酸物質(zhì)中色氨酸屬于疏水性氨基酸，能促進(jìn)藻細(xì)胞的絮凝，A和C峰代表的腐殖酸類物質(zhì)具有親水性膠體性質(zhì)，在高濃度時(shí)呈膠體溶液或分散體系[26]，會(huì)抑制藻細(xì)胞絮凝。其中兼養(yǎng)組藻細(xì)胞EPS中T、A和C峰強(qiáng)度比顯著高于自養(yǎng)藻細(xì)胞。

圖 3 培養(yǎng)基供氮水平1 N和1/3 N時(shí)蛋白核小球藻胞外蛋白和多糖含量變化Fig. 3 Change in contents of extracellular proteins and polysaccharides of Chlorella pyrenoidosa grown in media with nitrogen supply levels of 1N and 1/3N

與轉(zhuǎn)接前種子藻細(xì)胞 (圖4A) 相比，第4天自養(yǎng)對(duì)照組和低氮組藻細(xì)胞EPS熒光圖中A峰和C峰均消失，T峰強(qiáng)度明顯減弱 (圖4A1、A2)，說(shuō)明此時(shí)胞外類腐殖酸物質(zhì)的含量極低，蛋白樣色氨酸物質(zhì)含量也下降；但1/3N低氮組T峰強(qiáng)度比對(duì)照組增加40.3%，說(shuō)明低氮脅迫處理能適當(dāng)減緩藻細(xì)胞EPS中蛋白樣色氨酸含量的降幅。兼養(yǎng)來(lái)源的藻細(xì)胞轉(zhuǎn)接培養(yǎng)4 d后，EPS熒光掃描圖中T、A和C峰強(qiáng)度均顯著降低，其中1/3N低氮組T峰、C峰和A峰的強(qiáng)度分別是對(duì)照組的83.6%、74.8%和54.8% (圖4B、B1、B2)，差異顯著，可見(jiàn)低氮脅迫組EPS中腐殖酸類物質(zhì)含量降幅較大。

2.5.2 對(duì)藻細(xì)胞絮凝率的影響 藻細(xì)胞EPS組分含量的改變可能影響其絮凝率，測(cè)定自養(yǎng)和兼養(yǎng)來(lái)源種子藻細(xì)胞絮凝率和低氮脅迫處理4天后的絮凝率(表2)。兼養(yǎng)組藻細(xì)胞絮凝率顯著低于自養(yǎng)組。經(jīng)1/3N低氮處理4天后，兼養(yǎng)和自養(yǎng)組藻細(xì)胞絮凝率為分別為78.46%和80.28%，均比對(duì)照組顯著提高。

3 討論

本結(jié)果表明，自養(yǎng)與葡萄糖兼養(yǎng)來(lái)源的蛋白核小球藻轉(zhuǎn)接入低氮培養(yǎng)基的第1天即開(kāi)始生長(zhǎng)分裂，3天后生長(zhǎng)減緩 (圖1)，說(shuō)明低氮脅迫對(duì)藻細(xì)胞的促生長(zhǎng)效應(yīng)主要表現(xiàn)在培養(yǎng)初期。所有試驗(yàn)組藻細(xì)胞轉(zhuǎn)接后初期油脂含量均顯著下降，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，1/6N和1/3N低氮脅迫處理組油脂含量出現(xiàn)先下降后回升的拐點(diǎn)現(xiàn)象 (圖1)。前人研究低氮脅迫提高藻細(xì)胞油脂含量的處理時(shí)間在5～12天之間，檢測(cè)間隔在1～3天之間[6,10,27]，但一般藻細(xì)胞油脂含量隨培養(yǎng)時(shí)間而升高，未報(bào)道油脂含量升降拐點(diǎn)現(xiàn)象。原因可能在于不同藻種存儲(chǔ)油脂的代謝功用存在差異，油脂合成與分解代謝對(duì)培養(yǎng)環(huán)境變化的響應(yīng)速率也不同。本文自養(yǎng)和兼養(yǎng)來(lái)源的藻細(xì)胞接入1/3N低氮培養(yǎng)基后油脂含量分別于第2天和3天出現(xiàn)回升拐點(diǎn)，說(shuō)明自養(yǎng)組蛋白核小球藻種子細(xì)胞對(duì)低氮脅迫的響應(yīng)速度比兼養(yǎng)組更為迅速。但葡萄糖兼養(yǎng)來(lái)源的藻細(xì)胞不僅初始油脂含量較高 (圖1)，胞內(nèi)外蛋白和淀粉 (多糖) 含量也較豐富 (圖2和圖3)，1/3N低氮脅迫4天后油脂產(chǎn)率最高，同比是自養(yǎng)組藻細(xì)胞的7.95倍。說(shuō)明種子細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)方式影響其對(duì)低氮脅迫處理的響應(yīng)水平，而且藻細(xì)胞生物量增長(zhǎng)與生化組分積累并不同步。Griffiths等[7]報(bào)道除螺旋藻外，小球藻、柵藻等10種微藻的生長(zhǎng)速率和油脂含量均在1/10N低氮脅迫條件下最高。本研究中蛋白核小球藻的油脂含量在1/3N即6 mmol/L硝酸鈉低氮處理?xiàng)l件下效果最佳。

對(duì)蛋白核小球藻胞內(nèi)外蛋白和淀粉 (多糖) 含量的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)表明，低氮組藻細(xì)胞胞內(nèi)外蛋白、淀粉含量在培養(yǎng)初期均顯著下降，且降幅高于對(duì)照組 (圖2和圖3)，這與Lee等[28]在萊茵衣藻C. reinhardtii上的研究結(jié)果相似。萊茵衣藻在氮限制條件下，氨基酸氧化酶的基因表達(dá)水平提高而淀粉的合成途徑將會(huì)被阻斷，原因在于藻細(xì)胞為了適應(yīng)低氮環(huán)境，既加強(qiáng)了非必需蛋白的降解，也阻斷了淀粉合成對(duì)能量的消耗。但Fernandes等[29]研究卻發(fā)現(xiàn)，氮限制條件下凱式擬小球藻細(xì)胞內(nèi)淀粉首先積累，待氮源耗盡之后，油脂含量開(kāi)始逐步上升，說(shuō)明淀粉是作為凱式擬小球藻碳與能量的初步儲(chǔ)存物質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)自養(yǎng)與兼養(yǎng)來(lái)源的藻細(xì)胞在低氮脅迫初期，油脂、淀粉和蛋白含量均迅速降低，與此相應(yīng)的是生物量的大幅升高，待藻細(xì)胞生長(zhǎng)逐步穩(wěn)定的3天時(shí)，油脂和胞內(nèi)淀粉作為儲(chǔ)備能源才開(kāi)始逐步回升 (圖1和圖2)。而且兼養(yǎng)和自養(yǎng)種子藻細(xì)胞油脂含量 (圖1)和胞內(nèi)淀粉含量高低變化同步，低氮脅迫處理后二者回升拐點(diǎn)出現(xiàn)時(shí)間也基本一致 (圖3)，由此可推測(cè)淀粉和油脂均作為蛋白核小球藻的儲(chǔ)能物質(zhì)，合成基本同步或淀粉合成后很快轉(zhuǎn)化為油脂儲(chǔ)存。至于蛋白質(zhì)含量指標(biāo)，除了兼養(yǎng)來(lái)源的藻細(xì)胞轉(zhuǎn)接入1N對(duì)照培養(yǎng)基3天后胞內(nèi)蛋白含量明顯回升外，其他組藻細(xì)胞轉(zhuǎn)接后胞內(nèi)外蛋白水平均維持在較低水平或持續(xù)下降，低氮脅迫組下降更為明顯 (圖2和圖3)。Geider等[30]報(bào)道三角褐指藻在氮脅迫條件下原初電子受體還原受阻而抑制了相關(guān)蛋白質(zhì)的合成。Chen等[31]發(fā)現(xiàn)低氮脅迫后藻細(xì)胞蛋白質(zhì)中部分氨基酸會(huì)發(fā)生分解代謝并能通過(guò)γ-氨基丁酸途徑、三羧酸循環(huán)再分配到脂質(zhì)代謝途徑進(jìn)行油脂合成。本研究蛋白核小球藻在1/3N低氮脅迫2天或3天后藻細(xì)胞油脂含量回升但胞內(nèi)外蛋白含量持續(xù)下降，是否涉及蛋白降解氨基酸的轉(zhuǎn)化分配有待進(jìn)一步探究。

微藻細(xì)胞的收獲成本在其生產(chǎn)成本中占比較大，藻細(xì)胞EPS組成與藻細(xì)胞絮凝收獲特性密切相關(guān)[32]。本研究所用蛋白核小球藻自養(yǎng)種子細(xì)胞EPS胞外蛋白和多糖含量較低 (圖3)，二者比值也較低，而且含有一定比例的富里酸和胡敏酸類腐殖酸物質(zhì) (圖4A)，這可能是其自絮凝率較低的原因。葡萄糖兼養(yǎng)的藻細(xì)胞EPS中對(duì)絮凝有促進(jìn)作用的蛋白類色氨酸物質(zhì)T峰強(qiáng)度比自養(yǎng)藻細(xì)胞增加34.3%，而不利于絮凝的腐殖酸類物質(zhì)，A峰和C峰強(qiáng)度卻比自養(yǎng)組分別增加了141.8%和64.3% (圖4)，這可能是葡萄糖兼養(yǎng)培養(yǎng)使藻細(xì)胞絮凝率下降的主要原因。與1N對(duì)照組相比，1/3N低氮組藻細(xì)胞EPS組分中蛋白樣類色氨酸和類腐殖酸物質(zhì)均顯著下降，但T峰下降幅度低于A峰和C峰，從而顯著提高了藻細(xì)胞的絮凝率 (圖4和表2)?？梢?jiàn)培養(yǎng)基組成的改變能影響微藻細(xì)胞EPS組分從而影響其絮凝收獲特性，在微藻人工培養(yǎng)技術(shù)中引入該項(xiàng)指標(biāo)具有重要意義。本研究結(jié)果能為蛋白核小球藻人工培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)化設(shè)計(jì)提供科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

蛋白核小球藻作為新食品資源開(kāi)發(fā)的優(yōu)良藻種，營(yíng)養(yǎng)方式和低氮脅迫處理對(duì)其藻細(xì)胞生化組分積累轉(zhuǎn)化動(dòng)態(tài)和收獲性能都具有顯著影響，而且胞內(nèi)外不同組分的含量變化與其生長(zhǎng)速率并不同步。1/3N低氮脅迫提高蛋白核小球藻的油脂產(chǎn)率和絮凝性能的效果最佳。