李同樂，劉秀河*，顏 麗

（齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院），山東 濟(jì)南 250000）

紅曲霉（Monascus）是三囊菌目的曲霉科紅曲霉屬腐生真菌，在我國已有上千年的應(yīng)用歷史[1]。紅曲米是以大米為原料，使用紅曲霉發(fā)酵生產(chǎn)而來的紅色米粒，又被稱為紅曲、赤曲、紅米。近些年來，人們發(fā)現(xiàn)紅曲產(chǎn)品對高血壓、高血脂具有良好的治療效果。紅曲在發(fā)酵過程中能產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，其中莫那可林K（Monacolin K）是主要的降脂因子[2]。莫那可林K對膽固醇的合成具有抑制作用，這是由于莫那可林K的結(jié)構(gòu)與3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶的結(jié)構(gòu)相似，對3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶具有了競爭性抑制作用，從而能抑制膽固醇的合成[3]，且并無明顯毒副作用[4]。

目前我國生產(chǎn)的紅曲米中莫那可林K的含量一般為8 mg/g左右，因此使用高產(chǎn)莫那可林K菌株，先通過單因素試驗(yàn)確定了7個紅曲霉發(fā)酵的影響因素的大致范圍，進(jìn)而通過正交試驗(yàn)確定紅曲米發(fā)酵的最佳條件，以提高紅曲米中莫那可林K的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅曲霉（紅色紅曲種）K10403：山東中惠生物科技股份有限公司；莫那可林標(biāo)準(zhǔn)品：美國Sigma公司；大米、麩皮、馬鈴薯、豆粕：市售；蛋白胨、葡萄糖、玉米漿、麥芽糖、丙三醇、可溶性淀粉、蔗糖、硝酸鈉、硝酸銨、酵母粉、乳酸、氫氧化鈉、瓊脂：北京奧博星科技有限公司。所用試劑均為分析純或生化試劑。

斜面培養(yǎng)基[5]：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂1.5%，121℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨0.4%，大米粉4%，豆粕1%，硝酸鈉0.3%，丙三醇3%，pH 4.4，121℃滅菌20 min。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：大米50%，麩皮5%，甘油3.5%，蛋白胨1.5%，初始含水量40%，pH5，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

HNY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器：天津歐諾儀器股份有限公司；TDL-40B離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；KS-080數(shù)顯式超聲清洗儀：潔康洗凈電器有限公司；LC-15C高效液相色譜：日本島津有限公司；SW-CJ-2G超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；BSY-200T高速粉碎機(jī)：溪岸五金藥具廠；YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 紅曲霉發(fā)酵生產(chǎn)莫那可林K工藝流程及操作要點(diǎn)

將紅曲霉的孢子從斜面上刮下至于無菌水中，制備孢子懸浮液，并稀釋至5.7×103個/mL。將15%孢子懸浮液接種到200mL種子培養(yǎng)基上[6]。將種子液在30℃條件下160 r/min搖床培養(yǎng)36h。將三角瓶中的種子液按照一定的接種量接種到裝有固體發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL培養(yǎng)容器中，低溫發(fā)酵3d，高溫發(fā)酵15d。將發(fā)酵18d的紅曲米置于50℃烘箱中烘干。

1.3.2 種子液條件的優(yōu)化

菌種的生長曲線及種齡的確定：配制種子培養(yǎng)基，30℃恒溫培養(yǎng)，定時取樣測定干質(zhì)量，確定種子液中菌體的生長狀況。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

發(fā)酵溫度對莫那可林K產(chǎn)量的影響：用固體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，分別選擇恒溫發(fā)酵（恒溫26℃、28℃、30℃、32℃）18 d和變溫發(fā)酵（前3 d 30℃、后15 d 26℃）[7]。測定紅曲米中莫那可林K的含量，考察不同溫度對莫那可林K產(chǎn)量的影響。

發(fā)酵時間對莫納可林K產(chǎn)量的影響：用固體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，每24 h取樣一次，測定紅曲米中莫那可林K的含量，考察發(fā)酵時間對莫那可林K產(chǎn)量的影響。

初始含水量的影響：在保持其他因素不變的前提下，分別考察固體發(fā)酵培養(yǎng)的含水量20%、30%、40%、50%、60%對莫那可林K產(chǎn)量的影響。

不同碳源及其含量的影響：分別以3.5%的葡萄糖[8]、麥芽糖[9]、蔗糖[10]、可溶性淀粉[11]替代初始培養(yǎng)基中的甘油，以初始培養(yǎng)基作為對照；分別向固體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%的葡萄糖，以初始培養(yǎng)基作為對照，考察發(fā)酵培養(yǎng)基碳源種類及其含量對莫那可林K產(chǎn)量的影響。

不同氮源及其含量的影響：分別以1.5%的玉米漿[12]、酵母粉[13]、硝酸銨、硝酸鈉[14]替代初始培養(yǎng)基中的蛋白胨，以初始培養(yǎng)基作為對照；分別向固體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的蛋白胨，以初始培養(yǎng)基作為對照，考察發(fā)酵培養(yǎng)基氮源種類及其含量對莫那可林K產(chǎn)量的影響。

不同初始pH值的影響：使用乳酸[15]調(diào)節(jié)固體發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值分別為4、5、6、7、8、9，考察發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值對莫那可林K產(chǎn)量的影響。

麩皮添加量的影響：在保持其他因素不變的前提下，分別考察固體發(fā)酵培養(yǎng)基麩皮含量2.5%、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%對莫那可林K產(chǎn)量的影響[16]。

1.3.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化紅曲霉產(chǎn)莫那可林K

根據(jù)單因素試驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果，以莫那可林K產(chǎn)量為評價指標(biāo)，選取培養(yǎng)基初始pH值（A）、初始含水量（B）、葡萄糖含量（C）、蛋白胨含量（D）4個因素進(jìn)行L（934）的正交試驗(yàn)，因素及水平見表1。

表1 紅曲霉產(chǎn)莫那可林K條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table1 Factors and levels of orthogonal experiments for Monacolin K production byMonascus

1.3.5 莫那可林K含量的測定方法

樣品處理：將紅曲米粉碎過40目篩，稱取400～600 mg樣品至50 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇定容提取，將提取物過0.45 μm濾膜后采用高效液相色譜對提取的莫那可林K的含量進(jìn)行測定。

色譜條件：KromasilC18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相為甲醇∶水∶磷酸=385∶115∶0.14（V/V）；柱溫20～25 ℃；進(jìn)樣量20 μL；流量1 mL/min；紫外檢測波長238 nm[17]。

莫那可林K含量的計(jì)算公式如下：

式中：X為莫那可林K的含量，mg/g；h1、h2為樣品中莫納可林K的峰面積；c為莫那可林標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量濃度，μg/mL；50為定容體積，mL；h3為莫那可林標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積；m為樣品稱取質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子液培養(yǎng)時間的選擇

圖1 種子生長曲線Fig.1 The growth curve of seeds

由圖1可知，培養(yǎng)36 h時為菌體的對數(shù)生長期，是接種的最佳時期。培養(yǎng)時間過短，菌種量少、生長緩慢；培養(yǎng)時間過長，菌種衰老，不利于莫那可林K的生產(chǎn)。因此選擇培養(yǎng)時間為36 h。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 發(fā)酵溫度對莫那可林K產(chǎn)量的影響

溫度是影響紅曲霉的生長和莫納可林K的產(chǎn)量，尋找適合紅曲霉生長和代謝產(chǎn)物合成的溫度至關(guān)重要[18]。由圖2可知，變溫發(fā)酵的紅曲米中莫那可林K含量為10.48 mg/g，明顯高于恒溫培養(yǎng)的紅曲米莫那可林K含量。因此選擇變溫發(fā)酵（前3 d 30℃、后15 d 26℃）。

圖2 不同發(fā)酵溫度對莫那可林K產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of different fermentation temperatures on the yield of Monacolin K

2.2.2 發(fā)酵時間對莫那可林產(chǎn)量K的影響

由圖3可知，發(fā)酵初期莫那可林K含量增長較慢，從第8天開始莫那可林K含量快速增長，第18天時發(fā)酵產(chǎn)物莫那可林含量最高，為10.68 mg/g，18 d以后莫那可林K含量開始降低。因此選擇最佳發(fā)酵時間為18 d。

圖3 不同發(fā)酵時間對莫那可林K產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of different fermentation time on the yield of Monacolin K

2.2.3 初始含水量對莫那可林K產(chǎn)量的影響

由表2可知，當(dāng)固體發(fā)酵培養(yǎng)基初始含水量過少時，不能為紅曲霉的生長提供足夠的水分；隨著含水量的增加，莫那可林K含量也增加，初始含水量為40%時，莫那可林K含量最高，為8.24 mg/g；當(dāng)含水量過高時，培養(yǎng)基中的游離水增加，不利于紅曲霉對氧氣的吸收，莫那可林產(chǎn)量隨初始含水量的增加而降低[19]。因此選擇固體發(fā)酵培養(yǎng)基的初始含水量為40%。

表2 不同初始含水量對Monacolin K含量的影響Table2 Effects of different initial water content on the yield of Monacolin K

2.2.4 不同碳源及其含量對莫那可林K產(chǎn)量的影響

由圖4a可知，葡萄糖作為培養(yǎng)基碳源時，紅曲米中莫那可林K含量高于其他碳源，總體上碳源結(jié)構(gòu)越簡單，對于紅曲米中莫那可林K含量的提高效果越明顯。這是由于紅曲霉可以將多糖轉(zhuǎn)化為可以利用的單糖[20]，但是在發(fā)酵初期菌種量少，淀粉酶的活力低，碳源無法滿足紅曲霉生長代謝的需要。由圖4b可知，當(dāng)葡萄糖添加量為3.0%時莫那可林K含量最高，為11.19 mg/g。因此選擇培養(yǎng)基的碳源為3.0%葡萄糖。

圖4 不同碳源（a）及葡萄糖添加量（b）對莫那可林產(chǎn)量的影響Fig.4 Effects of different carbon sources(a)and addition of glucose(b)on the yield of Monacolin K

2.2.5 不同氮源及其含量對莫那可林K產(chǎn)量的影響

由圖5a可知，蛋白胨作為培養(yǎng)基氮源時，紅曲米中莫那可林K的產(chǎn)量最高。有機(jī)氮源作為附加氮源比無機(jī)氮源作為附加氮源對于莫那可林K的生產(chǎn)更加有利，可能是由于有機(jī)氮源中含有紅曲霉所需的必需氨基酸[21]。由圖5b可知，當(dāng)?shù)鞍纂说暮繛?.5%時莫那可林K含量最高，為13.14 mg/g。因此選擇培養(yǎng)基的氮源為1.5%蛋白胨。

圖5 不同氮源（a）及蛋白胨添加量（b）對莫那可林產(chǎn)量的影響Fig.5 Effects of different nitrogen sources(a)and addition of peptone(b)on the yield of Monacolin K

2.2.6 不同初始pH值對莫納可林K產(chǎn)量的影響

由圖6可知，紅曲米中莫那可林K含量隨初始pH值的升高呈先增加后加少的趨勢，初始pH值為5時，紅曲米中莫那可林K含量最高，為11.44 mg/g，當(dāng)pH＞5時莫那可林K含量隨pH值的升高而降低。酸性條件比堿性更適合紅曲霉的生長和莫納可林K的生產(chǎn)，紅曲霉是一種嗜酸菌[22]。因此選擇培養(yǎng)基的初始pH值為5。

圖6 不同初始pH對莫那可林K產(chǎn)量的影響Fig.6 Effects different initial pH values on the yield of Monacolin K

2.2.7 麩皮含量對莫納可林產(chǎn)量K的影響

由圖7可知，紅曲米的莫那可林K含量隨麩皮含量的增加呈先增加后減少的趨勢，當(dāng)麩皮含量為7.5%時莫那可林K的產(chǎn)量最高，為11.27 mg/g；當(dāng)麩皮含量＞7.5%時莫那可林K含量隨麩皮含量的升高而降低。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基里添加一定量的麩皮可以起到支撐培養(yǎng)基的作用，通過提高培養(yǎng)基通透性、減少培養(yǎng)基中的游離水以提高莫那可林K的產(chǎn)量。因此選擇培養(yǎng)基的麩皮含量為7.5%。

圖7 不同麩皮含量對莫那可林K產(chǎn)量的影響Fig.7 Effects of different bran content on the yield of Monacolin K

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

由表3可知，對紅曲霉產(chǎn)莫那可林K的影響依次為B＞D＞C＞A，即初始含水量是影響固體發(fā)酵的最重要因素。最佳發(fā)酵條件組合為A2B3C1D2，即初始含水量50%、蛋白胨含量1.5%、葡萄糖含量2.5%、初始pH值5。在最佳條件下進(jìn)行3組驗(yàn)證試驗(yàn)，紅曲米中莫那可林含量為14.22 mg/g。

表3 紅曲霉產(chǎn)莫那可林K條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table3 Results and analysis of orthogonal experiments for Monacolin K yield byMonascus

由表4可知，初始加水量對紅曲米中莫那可林K的含量有顯著影響（P＜0.05），其他因素不顯著（P＞0.05）。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table4 Variance analysis of orthogonal experiments results

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交優(yōu)化試驗(yàn)對紅曲霉發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得紅曲霉的最佳培養(yǎng)培養(yǎng)基組成是大米38.5%、麩皮7.5%、蛋白胨1.5%、葡萄糖2.5%、初始含水量50%，最佳培養(yǎng)條件為初始pH 5、30℃培養(yǎng)3 d轉(zhuǎn)入26℃培養(yǎng)15 d。在此優(yōu)化條件下，發(fā)酵的紅曲米中莫那可林K含量為14.05 mg/g。