■伍國耀

(美國德克薩斯州農(nóng)工大學動物科學系，大學城 77843)

2.2.3 基因（基因組）編輯生產(chǎn)基因敲除或敲入的轉(zhuǎn)基因動物

最初用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因家畜的方法會導致隨機轉(zhuǎn)基因的插入，因此需要新技術(shù)來提高基因靶向效率。通過原核注射將DNA遞送到受精卵中的方法在概念上是簡單的，但該方法在技術(shù)上具有挑戰(zhàn)性，并且注射的DNA構(gòu)建體會隨機整合到基因組中，產(chǎn)生不可預測的轉(zhuǎn)基因表達譜。此外，顯微注射會損傷受精卵，并且還需要昂貴的設(shè)備。這些缺點能夠通過基因（基因組）編輯方法的發(fā)展部分性克服，該方法使用序列特異核酸酶（作為一對分子剪刀）在所需的基因組位點產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂（圖5）。隨后，兩種內(nèi)源性修復機制之一可以修復DNA雙鏈斷裂：非同源末端連接（non-homologous end joining,NHEJ）和同源定向修復（homology-directed re?pair,HDR）。在容易出錯的非同源末端連接途徑中，DNA雙鏈斷裂的兩個末端匯聚并連接在一起，然而沒有同源模板用于修復，其經(jīng)常插入或刪除核苷酸（插入缺失）以引起基因破壞。如果插入缺失標記導致移碼突變，則靶基因可能失去功能（敲除）。同源定向修復途徑需要提供外源DNA模板以及位點特異性基因組編輯核酸酶以修復DNA雙鏈斷裂，從而導致所需的DNA序列插入胚胎或動物細胞的基因組中。在實踐中，靶基因的修飾通常通過顯微注射來實現(xiàn)，體外受精或胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)移獲得的胚胎，通過基因編輯系統(tǒng)（由內(nèi)源核酸酶的DNA序列、指導RNA和DNA模板組成）修飾。

早期的序列特異核酸酶是鋅指蛋白核酸酶（ZFN，第一個基因編輯工具），隨后發(fā)現(xiàn)的序列特異核酸酶是轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶（TALEN，第二個基因編輯工具），兩者都含有適應(yīng)性強的DNA結(jié)合域的模塊化蛋白質(zhì)。ZFN方法涉及產(chǎn)生一種包含能與DNA結(jié)合的鋅指結(jié)構(gòu)域和有限制性內(nèi)切核酸酶活性的結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。TALEN方法利用含有能與DNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域和單獨的能切割DNA的結(jié)構(gòu)域的工程酶。近年來，成簇規(guī)律間隔的短回文重復-核酸酶-9（CRISPR/Cas9）被用作核酸酶，為基因組工程提供更高效、更準確、更通用、更強大、更簡單的設(shè)計工具（Tan等，2016；Niu等，2017)。ZFN、TALEN或CRISPR/Cas9組分通過轉(zhuǎn)染（基于脂質(zhì)的試劑，電穿孔，核轉(zhuǎn)染或顯微注射）或噬菌體遞送到靶細胞中，這取決于細胞類型和質(zhì)粒（Bamford等2014；Bikard等，2014；Kim等，2010)。

在過去的5年中，CRISPR/Cas9作為家畜物種的首選基因編輯工具迅速獲得了應(yīng)用。CRISPR/Cas9系統(tǒng)于2007年在細菌（如革蘭氏陽性球菌或球形細菌屬）和古細菌中被發(fā)現(xiàn)，被用于抵御入侵的病毒（噬菌體）。細菌受病毒感染后，CRISPR/Cas9將被短RNA片段（被稱為指導RNA）引導剪切一段病毒DNA，在其靶基因座中產(chǎn)生雙鏈斷裂。指導RNA與靶生物的基因組區(qū)段互補，因此Cas9核酸酶能夠高度特異性地切割DNA。值得注意的是，Cas9對靶DNA的識別取決于直接位于非靶向DNA鏈下游的前間隔序列鄰近基序（PAM）的存在（Ryu等，2018）。因此，作為核糖核蛋白的CRISPR系統(tǒng)由兩種組分組成，Cas9內(nèi)切核酸酶和指導RNA。在實驗上，可以使用實驗室中的分子生物學工具設(shè)計指導RNA，將Cas9導向幾乎任何基因組位點的DNA，將其進行切割。表2中列出了使用CRIS?PR/Cas9生產(chǎn)基因編輯豬的里程碑。

2.2.3.1 優(yōu)勢

傳統(tǒng)的畜牧業(yè)受到諸如繁殖周期長和遺傳資源限制等問題的困擾。相比之下，基因組編輯工具通過提供更精確、更具體、更可預測和更快速的解決方案，能夠以相對可承受的成本來解決這些問題（Ryu等，2018）。CRISPR除敲除基因功能外，還能夠從動物基因組中刪除大的DNA片段。此外，基因編輯技術(shù)與先前的動物轉(zhuǎn)基因方法相比，步驟少并且更效率。例如，Tan等（2016）報道，他們在對家畜受精卵的基因編輯中能夠通過ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9技術(shù)實現(xiàn)30%的編輯頻率。與其它基因沉默技術(shù)（如RNAi）相比，CRISPR/Cas9具有更高的效率、更易于設(shè)計和更大的靈活性。據(jù)報道，幾個實驗室已經(jīng)成功地生產(chǎn)了基因編輯豬，這些豬可以用作器官供體、疾病模型、生物反應(yīng)器、豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的滅活，或生產(chǎn)具有提高生產(chǎn)力（如肌肉生長）或抗病性狀的轉(zhuǎn)基因動物（Fischer等，2018；Tan等，2016）。因此，基因編輯已經(jīng)成功應(yīng)用到家畜基因組的單基因和多等位基因的修飾，以及在胚胎發(fā)育過程中外源基因的位點特異性的引入。

圖5 使用ZFN、TALEN或CRISPR/Cas9技術(shù)對動物進行基因（基因組）編輯

表2 使用CRISPR/Cas9生產(chǎn)基因編輯豬的里程碑

表3中總結(jié)了具有重要生產(chǎn)性狀的轉(zhuǎn)基因豬的實例。首先，使用TALEN作為基因編輯器破壞肌肉生長抑制素（MSTN，肌細胞生成的負調(diào)節(jié)因子），成功地創(chuàng)造了MSTN敲除豬，其表現(xiàn)出雙肌肉表型、更高的體重和背最長肌肌肉質(zhì)量以及多于野生型豬100%的肌纖維數(shù)量（Rao等，2016）。第二，Zheng等（2018）利用CRISPER/Cas9技術(shù)生產(chǎn)出具有功能性解偶聯(lián)蛋白1（UCP1）的豬。UCP1在許多動物物種的棕色脂肪組織中表達，發(fā)揮非寒戰(zhàn)產(chǎn)熱的功能，從而在防寒和調(diào)節(jié)能量穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用。然而，現(xiàn)代豬缺乏功能性UCP1，因此很容易受到冷應(yīng)激，導致新生兒死亡率高，并且在體內(nèi)自發(fā)積累大量白色脂肪組織，導致生產(chǎn)性能下降（Ji等，2017）。值得注意的是，通過CRIS?PR/Cas9作為編輯器將小鼠脂聯(lián)素-UCP1基因插入到豬內(nèi)源性UCP1基因座中生產(chǎn)UCP1-敲入豬，其表現(xiàn)出體溫維持能力增加、白色脂肪沉積減少和組織中胴體瘦肉增加（Zheng等，2017）。第三，CRISPR/Cas9基因靶向和SCNT技術(shù)已被用于產(chǎn)生沒有CD163基因的豬，此基因編碼豬生殖和呼吸綜合征病毒（PRRSV，也稱為“藍耳病”）的細胞受體。例如，Burkard等(2018）報道，具有CD163敲除的豬對PRRSV具有完全抗性。Yang等(2011)也觀察到類似的結(jié)果。雄性和雌性個體可以用作種畜生產(chǎn)PRRSV抗性的后代。

表3 通過秀麗隱桿線蟲生產(chǎn)具有重要生產(chǎn)性狀的轉(zhuǎn)基因豬

2.2.3.2 缺點

盡管ZFN方法在位點特異性基因編輯方面實現(xiàn)了首次突破，但它仍有一些局限性，例如DNA的脫靶切割、細胞毒性、昂貴、耗時和效率低，因此一次只能進行一次基因組編輯，并且在準備有效的ZFN工具上也面臨著技術(shù)挑戰(zhàn)（Ryu等，2018）。與ZFN編輯器相比，TALEN技術(shù)在基因工程中更加靈活，因為其DNA結(jié)合域可以靶向更廣泛的DNA序列。雖然TALEN比ZFN更容易設(shè)計，但TALEN方法價格昂貴且在技術(shù)上難以同時對基因組進行多次編輯。除此之外，通過顯微注射將基因編輯Cas9直接遞送至胚胎仍然是一個具有挑戰(zhàn)性的過程，并且顯微注射本身可能損害胚胎。目前來說，通過現(xiàn)用的基因編輯方法所產(chǎn)生胎兒的產(chǎn)前死亡率遠高于常規(guī)胎兒。迄今為止，包括豬在內(nèi)的家畜基因編輯效率仍然不理想?；蚓庉嫷某绦驊?yīng)該更容易和更廉價，這樣更多的生產(chǎn)者才能夠在他們自己的農(nóng)場利用這種創(chuàng)新技術(shù)來改善動物繁殖。

3 通過生物技術(shù)理解動物和人類的抗生素耐藥性

自從1928年青霉素被發(fā)現(xiàn)以來，抗生素被普遍用于治療人類和動物的細菌感染。19世紀60年代以來，人們開始在傳統(tǒng)日糧內(nèi)添加亞治療劑量的抗生素用以提高豬和禽類的生產(chǎn)性能。然而，由于耐藥菌的產(chǎn)生和傳播，許多國家已經(jīng)禁止飼用抗生素的使用（如：歐盟各國）；并且一些主要的豬肉輸出大國，如美國和中國等國家已經(jīng)在逐步淘汰飼用抗生素。一些耐藥菌僅耐受一類抗生素，但有些耐藥菌可耐受多種抗生素，因此導致了嚴重的全球健康問題（Koch等，2017）。為了確?？股卦谥委熑祟惡蛣游锏募毦腥旧习l(fā)揮最好效果，全世界對于抗生素耐藥性（antimicrobial resis?tance，AMR）的擔憂日益加劇，抗生素耐藥性被定義為細菌能耐受抗菌藥物（如：抗生素）的能力。

微生物的抗生素耐藥基因可能會通過分裂從母細胞遺傳到子細胞，也可以通過質(zhì)粒從一株細菌轉(zhuǎn)移至另一株細菌。有趣的是，細菌體內(nèi)的質(zhì)粒（獨立于染色體DNA的小DNA分子）通常會攜帶一些信息，這些信息可以通過耐受自身或環(huán)境中其他微生物產(chǎn)生的抗生素，進而利于自身生存（Kim等，2016）。2007年，人們在分析中國分離的黏桿菌素耐受大腸桿菌時，發(fā)現(xiàn)了一個帶有19種抗生素耐藥基因的質(zhì)粒。在那以后，這令人煩惱的抗生素很長一段時間無人使用，這導致細菌的抗性水平降低；但當再次使用后，細菌抗性水平會再次升高（Dutil等，2010）。因此，迫切需要確定新的方法，來替代在全球豬生產(chǎn)中使用的飼用抗生素。通過生物技術(shù)來了解抗生素耐藥性的發(fā)生原理，將極大促進這一進程。

大量證據(jù)表明，細菌自然會獲得新的基因（包括抗生素耐藥基因），以便在新宿主體內(nèi)存活（Greene，2018）?？股啬退幓驎a(chǎn)生多種酶（例如，大腸桿菌內(nèi)的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶）以破壞或滅活抗生素（圖6）。例如，青霉素耐受細菌（如：金黃色葡萄球菌和大腸桿菌）通過合成的β-內(nèi)酰胺酶，將青霉素的內(nèi)酰胺環(huán)分解為一種非活性物質(zhì)。通過這種機制，細菌能不被青霉素殺死，從而產(chǎn)生抗生素耐藥性。現(xiàn)在，正在開發(fā)基于CRISPR技術(shù)的方法，用于殺死抗生素耐受細菌。因為CRISPR/Cas具有選擇性地靶向特定DNA序列的能力，因此可以很容易地區(qū)分致病菌或共生菌種類（Choi等，2016；Kim等，2016）。特別值得注意的是，噬菌體（對動物和人類來說通常是安全的）已經(jīng)被用來運送CRISPR/Cas系統(tǒng)至細菌體內(nèi)（Greene，2018）。例如，沒有自身DNA的噬菌體會得到一種編碼的DNA，這種DNA可以編碼一個向?qū)NA和Cas9（Bikard等，2014）。噬菌體然后被轉(zhuǎn)入抗藥性細菌（例如：艱難梭狀芽孢桿菌），Cas9被向?qū)NA引導去切割在特定位點的細菌DNA，誘發(fā)細菌自毀（圖7）。類似地，CRISPR/Cas3系統(tǒng)已經(jīng)通過噬菌體運送到革蘭氏陽性和陰性細菌，在多個位點切割DNA分子，從而誘導細胞程序性死亡（Reardon，2017）。此外，Kim等（2016）利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除了產(chǎn)生抗生素耐藥性的基因，恢復多重耐藥菌的敏感性，使其能夠被抗生素殺死。最后，CRISPR/Cas9系統(tǒng)被構(gòu)造成CRISPR干擾（CRISPRi）質(zhì)粒載體，攜帶滅活的Cas9的DNA序列和向?qū)NA，已被用于消除膜結(jié)合毒性蛋白（如：凝血酶A和腸毒素C）和金黃色葡萄球菌（革蘭氏陽性細菌，Sato’o等，2018）的抗生素耐藥基因（如：β-內(nèi)酰胺酶）。在這種方法中，滅活的Cas9中有兩個域發(fā)生了突變，并且這種蛋白質(zhì)只有DNA結(jié)合活性而不能分裂DNA。滅活的Cas9（dCas9）的結(jié)合，阻止細菌的轉(zhuǎn)錄機制調(diào)控目標基因，從而使其表達沉默，干擾細菌基因表達。因此，包含噬菌體或質(zhì)粒在內(nèi)的CRISPR/Cas9技術(shù)，有望殺滅和清除動物胃腸道中包括抗生素耐藥細菌在內(nèi)的細菌以及細菌產(chǎn)生的酶（表4）。該技術(shù)的實際應(yīng)用是減輕抗菌素抗性并開發(fā)豬飼料中抗生素的替代物。這種基因工程方法，以及飼料發(fā)酵和利用飼料蛋白制備抗菌肽(Hou等，2017)，有望最大限度地提高養(yǎng)分利用效率，并維持全球豬肉行業(yè)的發(fā)展。

圖6 細菌抗生素耐藥性發(fā)展的機制

總而言之，對高品質(zhì)肉類蛋白質(zhì)的需求，促使全球豬肉業(yè)提高生產(chǎn)率，同時減少碳排放和廢物排泄。為了實現(xiàn)這一目標，在過去的35年里，動物生物技術(shù)取得了革命性的進步，生產(chǎn)了重組蛋白質(zhì)（包括酶）、有機營養(yǎng)（包括氨基酸和維生素）、克隆豬和用于生物醫(yī)學和農(nóng)業(yè)用途的轉(zhuǎn)基因豬。近年來，基于鋅指核酸酶（ZFN）、TALEN和CRISPR/Cas9的基因（基因組）編輯技術(shù)已經(jīng)可以用于在DNA序列的特定位點上刪除、插入，或修飾動物和細菌的基因組。與ZFN和TALEN基因編輯相比，CRISPR/Cas9的效率更高、脫靶效應(yīng)更低、更易于設(shè)計，CRISPR/Cas9為基因工程學提供了更高效、更易于設(shè)計，并且更靈活的思路。因此，這種生物技術(shù)在保護豬的品種多樣性、提高飼料效率和豬肉產(chǎn)量，以及在未來開發(fā)抗生素替代品方面均具有廣闊前景。

致謝：

作者實驗室的研究工作得到了美國德州農(nóng)工大學AgriLife Research的支持（H-8200）。

圖7 利用CRISPR系統(tǒng)作為新的抗生素替代品