■林華林 秦穎超 周加義 王修啟

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院廣東省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室國(guó)家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東廣州 510642）

近幾十年來(lái)，為了降低集約化養(yǎng)殖模式下畜禽疾病的發(fā)生率，提高生產(chǎn)性能，抗生素被廣泛應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)?？股氐拇罅渴褂秒m在一定程度上抑制了有害菌的生長(zhǎng)，增強(qiáng)了機(jī)體的免疫力，但由于監(jiān)管難度大，不可避免造成了抗生素的濫用，增加了抗生素的殘留以及超級(jí)細(xì)菌的產(chǎn)生和擴(kuò)散機(jī)率[1]，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)健康。鑒于此，世界衛(wèi)生組織倡議慎用抗生素，1986年，瑞典便開(kāi)始全面禁止在飼料中添加抗生素，近十五年，歐盟、韓國(guó)和美國(guó)也出臺(tái)相關(guān)禁抗政策。2016年，農(nóng)業(yè)部刪除了附錄1產(chǎn)品中的硫酸黏菌素預(yù)混劑，2018年在13號(hào)文——《獸用抗菌藥使用減量化行動(dòng)試點(diǎn)工作方案(2018～2021年)》中明確指出，藥物飼料添加劑將在2020年全部退出。

我國(guó)微生態(tài)學(xué)奠基人魏曦先生曾預(yù)言：抗生素之后的時(shí)代將是微生態(tài)制劑時(shí)代[2]。微生態(tài)制劑作為一種抗生素代替物，具有更綠色、健康、安全的特點(diǎn)。微生態(tài)制劑類(lèi)的藥品、保健食品正逐漸涌入市場(chǎng)并形成產(chǎn)業(yè)[3]。丁酸梭菌作為微生態(tài)制劑類(lèi)的飼料添加劑，可有效改善畜禽腸道健康，增強(qiáng)機(jī)體免疫，促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)。因此，本文以丁酸梭菌及其代謝產(chǎn)物對(duì)腸道健康，包括對(duì)機(jī)體腸道屏障和免疫的影響及其可能的作用機(jī)制做一綜述，以期為丁酸梭菌產(chǎn)品升級(jí)和開(kāi)發(fā)更加高效的復(fù)合型微生態(tài)制劑提供思路。

1 丁酸梭菌代謝產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)功能

丁酸梭菌在腸道中通過(guò)發(fā)酵作用能產(chǎn)生多種物質(zhì)，包括各種酶類(lèi)、維生素、短鏈脂肪酸等，這些物質(zhì)不僅可以補(bǔ)充機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)需要，而且能促進(jìn)腸道對(duì)飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收和利用，提高畜禽的生長(zhǎng)性能。王潤(rùn)之等[4]發(fā)現(xiàn)，日糧中添加丁酸梭菌可顯著提高種番鴨蛋的受精率，且這種作用是通過(guò)丁酸梭菌在腸道內(nèi)代謝產(chǎn)生的多種維生素和酶類(lèi)等物質(zhì)加強(qiáng)了種番鴨對(duì)鈣、磷、錳、鋅、銅和鐵等礦物質(zhì)的吸收以滿(mǎn)足番鴨繁殖性能的需要實(shí)現(xiàn)的。

1.1 酶類(lèi)

丁酸梭菌在腸道無(wú)氧環(huán)境中代謝，產(chǎn)生了蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、糖苷酶、纖維素酶等消化酶，與腸道中分泌的腸酶體系共同作用，把進(jìn)入腸道的大分子碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪等酶解成單糖、短肽或氨基酸、甘油-脂或甘油等小分子物質(zhì)，能被小腸直接吸收和利用，從而顯著提高了飼料中的營(yíng)養(yǎng)吸收效率。Takahashi等[5]研究證實(shí)，補(bǔ)充丁酸梭菌能顯著提高仔豬和肉雞的飼料轉(zhuǎn)化率（Feed Conversion Rate,FCR）和平均日增重（Average Daily Gain,ADG）。Liao等[6]在肉雞上的試驗(yàn)和李玉鵬等[7]在斷奶仔豬上的試驗(yàn)與上述結(jié)果一致。此外，Nakajima等[8]發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌在大腸中產(chǎn)生的外切和內(nèi)切果膠裂解酶以及果膠甲酯酶，能通過(guò)協(xié)同作用參與果膠等物質(zhì)的消化，產(chǎn)生4,5-不飽和二半乳糖醛酸，然后在其它酶的作用下進(jìn)一步被分解成一些短鏈脂肪酸[9]，為腸道上皮細(xì)胞發(fā)育提供能量。

1.2 維生素

丁酸梭菌在腸道中能產(chǎn)生多種B族維生素（如核黃素、煙酸、吡哆醇、泛酸和葉酸等[10]）和維生素E等[11]。維生素B以輔酶的形式參與體內(nèi)碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪代謝，維持機(jī)體正常生理活動(dòng)。其中核黃素和煙酸經(jīng)磷酸化作用與蛋白質(zhì)結(jié)合成的脫氫酶對(duì)于維持機(jī)體生物氧化和細(xì)胞呼吸至關(guān)重要；吡哆醇磷酸化后作為脫羧酶和轉(zhuǎn)氨酶的輔酶參與氨基酸代謝；泛酸可與焦磷酸等生成輔酶A，參與三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝和生物轉(zhuǎn)化過(guò)程；而葉酸作為一碳單位的載體，主要參與嘌呤和嘧啶的合成。維生素E則有助于腸黏膜損傷的修復(fù)，促進(jìn)傷口愈合。Cadir等[12]發(fā)現(xiàn)，給大鼠口服維生素E可降低缺氧造成的腸道形態(tài)學(xué)損傷。此外，提前用維生素E干預(yù)能夠減輕電離輻射所致的腸道炎癥，且這種作用與維生素E的抗氧化性有關(guān)[13]。

1.3 短鏈脂肪酸

丁酸梭菌在厭氧發(fā)酵過(guò)程中能產(chǎn)生大量的短鏈脂肪酸（Short-Chained Fatty Acid,SCFA），包括乙酸、丙酸、丁酸等，它們均能被結(jié)腸上皮細(xì)胞吸收利用[14]，為細(xì)胞提供能量來(lái)源[15]，其中有超過(guò)70%的能量來(lái)自丁酸的氧化。除此之外，丁酸梭菌也能為腸道中的其它益生菌，包括雙歧桿菌和乳酸菌等的生長(zhǎng)繁殖提供能量[16]。丁酸梭菌是最有效的丁酸生產(chǎn)者[17]，且在所有的SCFA中，丁酸的代謝率最高。因此，丁酸梭菌的功效部分依賴(lài)于丁酸的作用。

1.3.1 丁酸的產(chǎn)生、吸收與利用(見(jiàn)圖1)

丁酸梭菌主要利用腸道中的谷氨酰胺和葡萄糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)生成丁酰CoA，丁酰CoA則通過(guò)丙酮酸途徑在磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶作用下生產(chǎn)丁酰磷酸鹽，最后經(jīng)丁酸激酶作用生成丁酸。此外，丁酰CoA還可在乙酸參與的情況下通過(guò)丁酰CoA-乙酰CoA轉(zhuǎn)移酶的作用生成丁酸和乙酰CoA。但究竟哪種是丁酸梭菌產(chǎn)生丁酸的主要途徑目前還存在爭(zhēng)議。

圖1 結(jié)腸上皮細(xì)胞中丁酸的吸收機(jī)制模型

丁酸主要在大腸中產(chǎn)生，經(jīng)被動(dòng)擴(kuò)散與特異性載體運(yùn)輸被盲腸和結(jié)腸上皮細(xì)胞吸收[18]。丁酸在腸道中存在解離和非解離形式，非解離的丁酸質(zhì)子化（與H+結(jié)合）后是脂溶性的，能夠以被動(dòng)擴(kuò)散的方式進(jìn)入上皮細(xì)胞內(nèi)，并釋放出H+，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)酸化。此時(shí)Na+/H+交換系統(tǒng)（Na+-H+Exchanger,NHE）被激活，增加H+的轉(zhuǎn)出和Na+的轉(zhuǎn)入，以保持細(xì)胞內(nèi)外pH值的穩(wěn)定[19-20]。因此腸上皮細(xì)胞以質(zhì)子化擴(kuò)散的方式吸收丁酸與細(xì)胞上的NHE活性之間存在功能性偶聯(lián)關(guān)系。而解離狀態(tài)的丁酸主要通過(guò)載體介導(dǎo)的丁酸陰離子與HCO3-進(jìn)行交換，這些載體包括腺瘤下調(diào)因子（Down Regulated in Adenoma，DRA）和假定陰離子1（Putative Anion 1,PAT1）等[21]。DRA和PAT1能轉(zhuǎn)進(jìn)解離的SCFA，同時(shí)轉(zhuǎn)出HCO3-。此外，當(dāng)上皮細(xì)胞內(nèi)的pH值上升時(shí)，陰離子交換劑2（Anion Ex?changers 2，AE2）被激活，也能將HCO3-轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞外。腸上皮細(xì)胞的頂端和基底外側(cè)膜均存在陰離子交換方式，但其對(duì)丁酸和HCO3－的轉(zhuǎn)運(yùn)方向恰好相反[20]。

丁酸被細(xì)胞吸收后，首先在細(xì)胞質(zhì)中經(jīng)丁酰CoA合成酶活化為丁酰CoA，然后在脫氫酶、水合酶以及硫解酶的作用下生成乙酰CoA，進(jìn)入三羧酸循環(huán)產(chǎn)生ATP[22]，為腸上皮快速提供能量。此外，丁酸產(chǎn)生的乙酰CoA以及通過(guò)羥甲基戊二酸單酰CoA途徑產(chǎn)生的酮體（乙酰乙酸、β-羥丁酸和丙酮）可作為腸上皮細(xì)胞合成其它物質(zhì)的底物。

1.3.2 提高腸道屏障功能

腸道是機(jī)體與外界進(jìn)行物質(zhì)交換的場(chǎng)所，不可避免會(huì)接觸大量有毒有害物質(zhì)。腸道上皮屏障能有效抵御這些微生物或毒素的入侵，而腸道完整性是腸上皮發(fā)揮屏障功能的基礎(chǔ)。丁酸有助于改善絨毛形態(tài)結(jié)構(gòu)，保護(hù)腸道屏障功能。

丁酸的高效利用能促進(jìn)結(jié)腸上皮細(xì)胞的增殖和分化，增加蛋白質(zhì)合成，抑制細(xì)胞凋亡[23]，加快腸上皮的更新，增加細(xì)胞間緊密連接[24-25]。增強(qiáng)腸道屏障功能。不僅如此，在損傷刺激的條件下，丁酸鹽還可促進(jìn)腸上皮再生，修復(fù)破損的腸黏膜。研究表明，仔豬早期斷奶會(huì)破壞腸道完整性，而日糧中添加丁酸能降低隱窩深度，提高絨毛高度與隱窩深度比值[26]，降低腸道通透性[27]。此外，丁酸還可逆轉(zhuǎn)脂多糖誘導(dǎo)的緊密連接蛋白和閉合蛋白表達(dá)的降低，增強(qiáng)腸道屏障功能，這可能與丁酸加快了緊密連接蛋白的遷移和裝配速度有關(guān)[28]。然而，腸道中高濃度的丁酸會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)腸黏膜損傷[29]。Kaiko等[30]研究發(fā)現(xiàn)，丁酸可降低斑馬魚(yú)腸道干細(xì)胞活性，而對(duì)小鼠結(jié)腸干細(xì)胞則無(wú)明顯作用。隱窩的特殊細(xì)胞結(jié)構(gòu)一定程度上能夠保護(hù)干細(xì)胞免受腸腔中某些因子的刺激。由于斑馬魚(yú)腸道中不存在隱窩結(jié)構(gòu)，丁酸可直接接觸腸道干細(xì)胞。值得深思的是，腸道干細(xì)胞是腸上皮更新或再生的動(dòng)力來(lái)源，丁酸的促生長(zhǎng)可能并非是它作為一個(gè)信號(hào)分子刺激腸道干細(xì)胞的增殖和分化，那么這種作用是通過(guò)什么樣的途徑實(shí)現(xiàn)的呢？這一問(wèn)題需待更進(jìn)一步的研究去解析。

2 調(diào)節(jié)腸道菌群平衡

腸道定植的菌群之間保持著相對(duì)平衡，它們共同維護(hù)了腸道微生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定。但這種動(dòng)態(tài)的平衡狀態(tài)易受外部因素和機(jī)體自身生理狀況的影響。尤其是幼年動(dòng)物，由于腸道發(fā)育不完全，微生態(tài)系統(tǒng)比較脆弱，致病性大腸桿菌等有害菌易于在腸道中繁殖，導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生腹瀉等腸道疾病[31]。研究表明，丁酸梭菌能夠通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)、排斥、替代以及改變腸道微環(huán)境來(lái)有效調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)的菌群平衡，抑制有害菌生長(zhǎng)[32]，從而有效降低動(dòng)物腹瀉率，大幅提高其成活率[33]。

1975年，Clarke等[34]首次在丁酸梭菌NCIB 7423菌株中分離純化一種多肽——丁酸梭菌素7423，這種丁酸梭菌素能夠有效抑制致病菌生長(zhǎng)繁殖。趙熙等[35]對(duì)植入丁酸梭菌的小鼠腸道內(nèi)容物進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中的雙歧桿菌和乳桿菌的數(shù)量相較于對(duì)照組明顯增加，而腸球菌、腸桿菌等致病菌的數(shù)量則顯著降低。體外試驗(yàn)同樣很好地說(shuō)明丁酸梭菌的抑菌效果[36]。

丁酸抑菌機(jī)理除了它通過(guò)各種方式抑制有害菌的黏附外[37]，還可通過(guò)調(diào)節(jié)腸道pH值達(dá)到抑制有害菌繁殖的目的。腸道中大多益生菌生活的最適pH值是偏酸性，而大部分致病菌為弱酸性偏堿性[38]，丁酸可微調(diào)腸道環(huán)境的pH值，從而促進(jìn)益生菌的生長(zhǎng)，抑制有害菌的生長(zhǎng)。而益生菌數(shù)量的增加會(huì)進(jìn)一步壓縮有害菌的生存空間，加劇了有害菌的脫落和死亡。

3 增強(qiáng)調(diào)節(jié)免疫機(jī)制

腸道是機(jī)體最大的免疫器官，其功能的發(fā)揮主要依賴(lài)于腸道相關(guān)黏膜免疫細(xì)胞的作用。丁酸梭菌能加強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答，增加免疫活性細(xì)胞的數(shù)量，降低腸道炎癥反應(yīng)。

腸道中Toll樣受體（TLR）可介導(dǎo)微生物分子的識(shí)別以消除病原體[39]，因此，其活性高低對(duì)于機(jī)體的免疫應(yīng)答的靈敏度至關(guān)重要[40]。研究發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌能提高腸道中TLR2 mRNA豐度，當(dāng)TLR2被敲除后，丁酸梭菌誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生的免疫應(yīng)答能力降低[41]，說(shuō)明TLR2介導(dǎo)了由丁酸梭菌加強(qiáng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)。

腸道相關(guān)黏膜免疫細(xì)胞包括肥大細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等是機(jī)體抵抗感染的第一線細(xì)胞。研究表明，日糧中添加丁酸鈉可增加腸道中肥大細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)量[42]，說(shuō)明丁酸鈉可增強(qiáng)腸道免疫能力。丁酸梭菌能夠在機(jī)體出現(xiàn)炎癥反應(yīng)時(shí)通過(guò)影響免疫細(xì)胞分泌某些抗炎因子抑制炎癥反應(yīng)，其中白細(xì)胞介素-10（IL-10）是丁酸梭菌588發(fā)揮抗炎作用的重要因子。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌588能誘導(dǎo)腸巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-10，且TLR2信號(hào)傳導(dǎo)可正向誘導(dǎo)IL-10的產(chǎn)生[43-44]，而IL-10的增加會(huì)抑制促炎性細(xì)胞因子IL-4的表達(dá)[45]。此外，有研究表明，TReg細(xì)胞在免疫穩(wěn)態(tài)的建立和維持以及抑制炎癥性免疫反應(yīng)和自身免疫中同樣起到了重要作用[46]，IL-10產(chǎn)生能增加TReg細(xì)胞的積累，達(dá)到保護(hù)結(jié)腸效果[47]。血液中的抗體水平也可間接說(shuō)明腸上皮黏膜的炎癥反應(yīng)程度。丁酸梭菌能顯著提高櫻桃谷肉鴨血清中C3、C4（補(bǔ)體系統(tǒng)重要組成部分）[6]，以及雞[48-49]和斷奶仔豬[50]血清中IgA、IgG和IgM的含量，表明丁酸梭菌增強(qiáng)了機(jī)體的免疫力，降低了炎癥反應(yīng)。NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)了炎癥反應(yīng)過(guò)程，其中，NF-κB是調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)的樞紐。有研究表明，丁酸鈉可抑制NF-κB的活性[51]。丁酸鈉還可通過(guò)抑制LPS應(yīng)答機(jī)制下調(diào)NF-κB通路表達(dá)，從而緩解炎癥反應(yīng)[52]。

4 提高抗氧化能力

丁酸梭菌代謝產(chǎn)生抗氧化酶，通過(guò)減少反應(yīng)性氧代謝物來(lái)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激[53-54]，從而提高機(jī)體的抗氧化能力。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）和超氧化物歧化酶（SOD）是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶，而丙二醇（MDA）是一種脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，反映了機(jī)體氧化應(yīng)激的程度。Liao等[6]研究表明，日糧中補(bǔ)充丁酸梭菌能顯著提高肉雞腸道中GSH-Px含量，同時(shí)降低腸黏膜MDA水平。丁酸梭菌也能產(chǎn)生具有清除活性氧的酶，即NADH和NADPH氧化酶。Kawasaki等[55]在丁酸梭菌的胞質(zhì)部分中檢測(cè)到了NADH/NADPH氧化酶以及SOD活性，機(jī)體通過(guò)它們清除腸道中活性氧來(lái)提高抗氧化能力。

5 小結(jié)

綜上所述，丁酸梭菌不僅能依靠自身調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，通過(guò)TLR介導(dǎo)機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)增強(qiáng)局部免疫力，而且其代謝產(chǎn)物對(duì)于提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收和機(jī)體抗氧化能力以及改善腸道屏障功能也起到了積極的正向作用。尤其是其產(chǎn)生的丁酸，作為結(jié)腸上皮細(xì)胞的主要能源物質(zhì)，可促進(jìn)腸道發(fā)育。由于丁酸在干細(xì)胞暴露的情況下會(huì)抑制它的增殖，那么丁酸作用于腸上皮細(xì)胞與腸道干細(xì)胞存在著怎樣的差異，以及它如何影響腸上皮細(xì)胞的增殖和分化過(guò)程都值得深入挖掘。鑒于丁酸梭菌及其代謝產(chǎn)物廣泛而有效的作用，因此有必要充分解析其促進(jìn)腸道發(fā)育、增強(qiáng)機(jī)體免疫的機(jī)制，為其在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用，包括抗生素替代以及新產(chǎn)品的研發(fā)提供理論依據(jù)。