■孟繁磊 宋志峰 譚 莉 魏春雁

（吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，吉林長春 130033）

黃曲霉毒素是由黃曲霉菌和寄生曲霉菌產(chǎn)生的一組真菌毒素代謝物，主要有4種天然存在的黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2。黃曲霉毒素對人類和動物都是有毒和致癌的，黃曲霉毒素B1和G1比黃曲霉毒素B2和G2毒性更大[1-2]。由于這種毒性，政府規(guī)定嚴(yán)格限制其在食物中的含量，因此，就需要靈敏、精確、可重復(fù)的方法來檢測這些毒素。這些方法主要有基于配有熒光檢測器的反相高效液相色譜法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。然而，因?yàn)榉聪嘞疵撘簳銣琰S曲霉毒素B1和G1的熒光效應(yīng)，通常需要衍生以增強(qiáng)這些分析物的反應(yīng)，主要有三氟乙酸進(jìn)行柱前衍生[3]以及使用碘法[4]、電化學(xué)衍生溴法[5]、光化學(xué)UV衍生法進(jìn)行柱后衍生[6-7]等，但這些方法存在前處理過程繁瑣或需要配備單獨(dú)的衍生系統(tǒng)等缺點(diǎn)。近年來，質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展提高了選擇性和靈敏度，并提供了區(qū)分目標(biāo)物與共提取物的能力，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜也廣泛應(yīng)用于黃曲霉毒素的檢測[8-10]。但飼料樣品基質(zhì)復(fù)雜，常常存在較大的基質(zhì)效應(yīng)干擾，通過基質(zhì)配標(biāo)的方法可以校正，但一些基質(zhì)特別復(fù)雜的樣品基質(zhì)效應(yīng)很難校正。將穩(wěn)定同位素稀釋方法配合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法應(yīng)用于飼料中黃曲霉毒素的檢測可以消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，同時(shí)還可以消除前處理過程中的損失，使檢測結(jié)果更準(zhǔn)確可靠。因此，本文建立了飼料中4種黃曲霉毒素的穩(wěn)定同位素稀釋-超高液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的檢測方法，優(yōu)化了前處理?xiàng)l件和儀器工作條件，以使方法能夠滿足飼料中黃曲霉毒素的檢測要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

乙腈和甲醇（色譜級），賽默飛世爾科技公司；黃曲霉毒素B1（5 μg/ml）、黃曲霉毒素B2（5 μg/ml）、黃曲霉毒素 G1（5 μg/ml）、黃曲霉毒素 G2（5 μg/ml）、13C17-AFTB1（0.5 μg/ml）、13C17-AFTB2（0.5 μg/ml）、13C17-AFTG1（0.5 μg/ml）、13C17-AFTG2（0.5 μg/ml），均購自美國Sigma公司；超純水用Millipore純水機(jī)制備。

1.2 儀器與設(shè)備

QTRAP 5500三重四級桿線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜儀（AB Sciex公司）；LC-30AD超高效液相色譜儀（島津公司）；KQ-500DE數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；X3R離心機(jī)（Thermo公司）；VG3 S025渦旋混勻器（德國IKA公司）；MyCOsepTM226多功能凈化柱[ROMER國際貿(mào)易(北京)有限公司]。

1.3 準(zhǔn)溶液配制

1.3.1 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（100 ng/ml）

分別取質(zhì)量濃度均為5 μg/ml的黃曲霉毒素B1（AFTB1）、黃曲霉毒素B2（AFTB2）、黃曲霉毒素G1（AFTG1）、黃曲霉毒素G2（AFTG2）各200 μl于10 ml容量瓶中，用乙腈定容至刻度，-20℃下密封避光保存。

1.3.2 混合同位素內(nèi)標(biāo)工作液(50 ng/ml)

準(zhǔn)確移取 0.5 μg/ml13C17-AFTB1、13C17-AFTB2、13C17-AFTG1、13C17-AFTG2各1 ml于10 ml容量瓶，用乙腈定容至刻度，-20℃下密封避光保存。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液

用50%的甲醇水溶液將混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(100 ng/ml)配成 AFTB1、AFTB2、AFTG1、AFTG2質(zhì)量濃度均為0.2、1、5、10、50、250 μg/l的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，使用時(shí)分別取此混合標(biāo)準(zhǔn)溶液450 μl與50 μl的混合同位素內(nèi)標(biāo)工作液(50 ng/ml)混勻即得標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取5 g飼料樣品（精確到0.01 g）于50 ml離心管中，加入250 μl同位素內(nèi)標(biāo)工作液混合后靜置30 min，加入20 ml乙腈-水（84∶16，v/v），漩渦混勻，超聲波提取30 min，5 000 r/min離心10 min，收集上清液經(jīng)MyCOsepTM226多功能凈化柱凈化，取4 ml凈化液于50℃下氮?dú)獯蹈?，? ml初始流動相溶解殘留物，漩渦混勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾于進(jìn)樣瓶中，UPLC-MS/MS檢測。

1.5 UPLC-MS/MS儀器條件

1.5.1 色譜條件

色譜柱:Waters BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm);流動相：A相為5 mmol/l甲酸銨溶液，B相為甲醇；梯度洗脫程序如下：0～1 min，36%B；3～4 min，50%B；4.2～5.5 min，100%B；5.6～8 min，36%B；流速：0.3 ml/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：3 μl。

1.5.2 質(zhì)譜條件

離子源：ESI；電離模式：正模式；監(jiān)測方式：多反應(yīng)監(jiān)測MRM；離子化電壓：5 500 V；氣簾氣30 psi；霧化溫度：550 ℃；霧化氣：55 psi；輔助氣：55 psi。其它質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

表1 4種黃曲霉毒素及其同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜條件

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

黃曲霉毒素常用的提取溶液為乙腈-水（84∶16，v/v）[11-12]和甲醇-水（70∶30，v/v）[13-14],本文以10 μg/kg的添加水平來考察兩種提取溶劑的提取效果，以4種黃曲霉毒素的回收率為考察指標(biāo)，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，用乙腈-水（84∶16，v/v）提取的回收率的略高，此外，乙腈-水（84∶16，v/v）為提取劑，對飼料中蛋白質(zhì)沉淀效果也較為明顯，所以，本文選擇乙腈-水（84∶16，v/v）為提取溶劑。

2.2 質(zhì)譜條件的選擇

將4種黃曲霉毒素及其同位素內(nèi)標(biāo)用50%的甲醇配成50 μg/l的單標(biāo)，通過針泵直接進(jìn)樣，測定其在ESI+和ESI-的質(zhì)譜信號強(qiáng)度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種黃曲霉毒素及其同位素內(nèi)標(biāo)在ESI+模式下，可以得到豐度值較高的[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰，確定[M+H]+為其母離子；然后優(yōu)化去簇電壓DP，保證母離子的傳輸；接著采用子離子掃描，選擇2個(gè)響應(yīng)值較強(qiáng)的子離子（同位素內(nèi)標(biāo)只選擇1個(gè)響應(yīng)最強(qiáng)的子離子用于定量），最后對碰撞能量CE進(jìn)行優(yōu)化。質(zhì)譜條件的選擇結(jié)果見表1。

圖1 提取溶劑的選擇

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

將1.3.3標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液按照1.5的條件依次進(jìn)樣檢測，以各黃曲霉毒素的濃度為橫坐標(biāo)x（μg/l），以各毒素峰面積與對應(yīng)毒素內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程、相關(guān)系數(shù)（r2），線性范圍見表2。結(jié)果表明，4種黃曲霉毒素在0.18～225 μg/l范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999 0。

2.3.2 方法的檢出限和定量限

用空白飼料樣品為基質(zhì)，以標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)濃度的添加量加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液后按照1.4處理后測定，以信噪比（S/N）為3，確定方法的檢出限，以信噪比（S/N）為10，確定方法的定量限，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，在本方法的檢測條件下，AFTB1、AFTB2、AFTG1、AFTG2的檢出限分別為 0.015、0.025、0.015、0.025 μg/kg，定量限分別0.05、0.1、0.05、0.1 μg/kg，滿足檢測的要求。

2.3.3 加標(biāo)回收率和重復(fù)性

向空白的飼料樣品中加入黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以回收率試驗(yàn)來考察本方法正確度，同時(shí)以回收率測試結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）考察方法的重復(fù)性。分別添加定量限、10倍定量限、限量值附近三個(gè)水平濃度，每個(gè)添加濃度平行測定6次，具體的添加濃度、回收率和RSD結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，4種黃曲霉毒素的平均回收率在76.19%～102.29%之間，符合《GB 27417—2017合格評定化學(xué)分析方法確定和驗(yàn)證指南》的要求，表明該方法用于提取測定飼料中4種黃曲霉毒素準(zhǔn)確可行；4種黃曲霉毒素平均回收率的RSD在1.91%～10.12%之間，表明該方法重復(fù)性良好。

表2 4種黃曲毒素的回歸方程、線性范圍、檢出限、定量限

表3 4種黃曲霉毒素的添加回收率（n=6）

3 結(jié)論

本文建立了穩(wěn)定同位素稀釋-UPLC-MS/MS技術(shù)測定飼料中4種黃曲霉毒素的方法。樣品經(jīng)乙腈-水（84∶16，v/v）溶液超聲波提取后，采用MyCOsepTM226多功能凈化柱凈化后，用UPLC-MS/MS進(jìn)行檢測。提取前加入穩(wěn)定同位素一方面消除了基質(zhì)效應(yīng)的影響，另一方面對前處理過程中的損失也給予了校正。本方法具有前處理操作簡單快速、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，結(jié)果滿足國家標(biāo)準(zhǔn)的要求，適用于飼料中4種黃曲霉毒素的定量分析，也可為其他基質(zhì)中4種黃曲霉毒素含量的檢測提供參考依據(jù)。