■李玉欣 王海彥 韓 博

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100193；2.北京華美源生物科技有限公司，北京 101199）

斷奶是仔豬生長發(fā)育過程中繼出生后的第二個關(guān)鍵時期，由于營養(yǎng)、環(huán)境和心理因素的作用，導(dǎo)致仔豬極易受到病原微生物的侵害而感染大腸桿菌病、氣喘病和沙門氏菌病等[1]，其中致病性大腸桿菌是導(dǎo)致仔豬斷奶腹瀉和死亡的一個主要原因[2]，腸道黏膜免疫是近些年才發(fā)展起來的一個獨(dú)特的研究領(lǐng)域，動物正常生理狀態(tài)時，腸道免疫系統(tǒng)與大量抗原接觸，腸黏膜既要對食源性抗原產(chǎn)生正確的免疫應(yīng)答反應(yīng)，保障機(jī)體對營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行消化吸收，又要產(chǎn)生免疫防御功能，抵抗外來抗原物質(zhì)的入侵，小腸上皮細(xì)胞間的淋巴細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和肥大細(xì)胞等免疫細(xì)胞數(shù)量的變化可以反映腸道的局部免疫狀況[3]。本試驗使用大腸桿菌攻毒模擬現(xiàn)實生產(chǎn)中仔豬腹瀉及腸道損傷條件下，研究畢赤酵母甘露寡糖對斷奶仔豬生產(chǎn)性能、腸上皮細(xì)胞內(nèi)免疫細(xì)胞數(shù)量變化與分布的影響，探討畢赤酵母甘露寡糖的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所使用的畢赤酵母甘露寡糖標(biāo)識含量為：甘露糖≥15%、甘露寡糖≥20%、蛋白質(zhì)≥25%，水分≤6%和粗灰分≤2%。

1.2 試驗動物分組與日糧

本試驗選用48頭平均體重為7.34 kg的健康斷奶仔豬，共飼養(yǎng)24 d。試驗初期分為兩個日糧處理組：對照組和0.2%畢赤酵母甘露寡糖組，對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗組在基礎(chǔ)日糧中額外添加0.2%畢赤酵母甘露寡糖，每個處理組設(shè)12個重復(fù)，每個重復(fù)2頭仔豬，所有飼糧均為干粉料（基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表1）。

表1 斷奶仔豬試驗基礎(chǔ)日糧的組成及營養(yǎng)水平

1.3 試驗動物管理

試驗在北京市海淀區(qū)蘇家坨鄉(xiāng)蘇三四種豬場進(jìn)行。該場保育舍為全封閉式豬舍，屋頂排氣扇通風(fēng)，舍內(nèi)溫度、通風(fēng)強(qiáng)度和濕度均為自動化系統(tǒng)控制，試驗豬只采取單籠飼養(yǎng)方式區(qū)分，豬舍內(nèi)溫度變化控制在（28.0±2.5）℃，干粉料飼喂，自由采食和飲水。豬舍內(nèi)漏縫金屬地板，不銹鋼可調(diào)式料槽，乳頭式飲水器。按豬場常規(guī)管理程序和免疫程序進(jìn)行飼喂和免疫接種。

1.4 大腸桿菌攻毒液體制備

本試驗攻毒所用2株大腸桿菌均為致病性大腸桿菌非模式菌株，其血清型分別為O64∶K99（C83709）、O138∶K88（C83905）。每種菌株接種在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中，經(jīng)過37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)12 h后離心收集菌體，并用PBS緩沖液洗滌、復(fù)溶到PBS緩沖液中調(diào)整到攻毒濃度，在試驗進(jìn)行到第14 d時，對照組、畢赤酵母甘露寡糖組的1/2仔豬每天每頭灌服30 ml濃度為1010CFU/ml（2個菌株按50∶50混合）的大腸桿菌培養(yǎng)液，另1/2的對照組和酵母甘露寡糖組的仔豬灌服相同劑量的PBS無菌培養(yǎng)液作為大腸桿菌攻毒的對照，直至灌服大腸桿菌攻毒組出現(xiàn)腹瀉癥狀為止。

1.5 檢測指標(biāo)

試驗開始和結(jié)束時逐個稱量每頭試驗仔豬的空腹體重，計算試驗期間的平均日增重；每天9：00和17：00觀察仔豬排糞情況并評分（見表2），腹瀉指數(shù)=糞便分?jǐn)?shù)之和/試驗仔豬頭數(shù)；于試驗結(jié)束時收集料槽中的剩余飼料，計算試驗期間的平均日采食量；根據(jù)平均日增重和平均日采食量計算飼料效率。于試驗第24 d，將各試驗組所有豬只提前12 h停食空腹待宰，處死后分別取十二指腸、空腸和回腸中段測定上皮間淋巴細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和肥大細(xì)胞數(shù)量。

表2 仔豬腹瀉指數(shù)評分

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件中的One-Way ANO?VA進(jìn)行統(tǒng)計處理，比較各個處理間的差異性用Dun?can's方法進(jìn)行多重比較，P＜0.05時確定為有顯著差異。

2 試驗結(jié)果與分析

2.1 畢赤酵母甘露寡糖對大腸桿菌攻毒后斷奶仔豬生長性能的影響（見表3）

表3 日糧中添加畢赤酵母甘露寡糖對大腸桿菌攻毒后斷奶仔豬生長性能的影響

大腸桿菌攻毒的試驗組的末重和平均日增重明顯優(yōu)于對照組（P＜0.05）。大腸桿菌攻毒組15～21 d仔豬的腹瀉指數(shù)顯著高于不攻毒組（P＜0.05），試驗組的腹瀉指數(shù)低于對照組。大腸桿菌攻毒明顯降低了對照組試驗?zāi)┲睾推骄赵鲋兀≒＜0.05）。日糧中添加0.2%畢赤酵母甘露寡糖能夠改善大腸桿菌攻毒對仔豬造成的試驗?zāi)w重和平均日增重的負(fù)面影響。

2.2 畢赤酵母甘露寡糖對大腸桿菌攻毒后斷奶仔豬腸道黏膜免疫細(xì)胞數(shù)量的影響（見表4）

由表4可知，大腸桿菌不攻毒情況下，畢赤酵母甘露寡糖可以提高斷奶仔豬腸黏膜上皮間淋巴細(xì)胞的數(shù)量，畢赤酵母甘露寡糖(試驗組)還有降低各段仔豬腸道黏膜肥大細(xì)胞數(shù)量的趨勢，但差異均不顯著（P＞0.05）。

大腸桿菌攻毒可以顯著提高回腸黏膜上皮細(xì)胞間淋巴細(xì)胞的數(shù)量（P＜0.05），大腸桿菌攻毒也可以顯著提高十二指腸杯狀細(xì)胞數(shù)量（P＜0.05），大腸桿菌攻毒有降低對照組各段腸道黏膜內(nèi)肥大細(xì)胞數(shù)量的趨勢，但差異不顯著（P＞0.05）。

表4 畢赤酵母甘露寡糖對斷奶仔豬十二指腸、空腸和回腸免疫細(xì)胞細(xì)胞數(shù)量的影響

與大腸桿菌不攻毒相比，給斷奶仔豬補(bǔ)充畢赤酵母甘露寡糖可以減緩大腸桿菌攻毒導(dǎo)致的空腸黏膜上皮細(xì)胞間淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞數(shù)量升高的趨勢，但對照組和試驗組間差異不顯著（P＞0.05）。畢赤酵母甘露寡糖顯著降低了大腸桿菌攻毒組回腸杯狀細(xì)胞的數(shù)量（P＜0.05）。畢赤酵母甘露寡糖對大腸桿菌攻毒導(dǎo)致十二指腸和空腸肥大細(xì)胞降低有減緩作用，但各組間差異均不顯著（P＞0.05）。

3 討論與分析

3.1 畢赤酵母甘露寡糖對大腸桿菌攻毒后生長性能的影響

本試驗在試驗后期對一半的仔豬進(jìn)行致病性大腸桿菌攻毒，并且導(dǎo)致攻毒仔豬出現(xiàn)黃色軟糞腹瀉癥狀，降低了平均日采食量和后期的增重速度，因此對照組攻毒仔豬出現(xiàn)了飼料效率下降的現(xiàn)象。試驗15～21 d試驗組仔豬攻毒后的腹瀉指數(shù)低于攻毒對照組，而且平均日采食量和飼料效率沒有下降，說明畢赤酵母甘露寡糖能夠提高斷奶仔豬對大腸桿菌攻毒的抵抗力，因而提高生長性能。

3.2 腸道黏膜免疫細(xì)胞數(shù)量的影響

正常健康生理狀況下，上皮淋巴細(xì)胞處于相對穩(wěn)定的水平，當(dāng)受到外界病原菌或斷奶等刺激時，淋巴細(xì)胞從血液向腸道上皮中遷移[4]，起到修復(fù)腸黏膜損傷和清除病原菌等作用。這是本試驗在大腸桿菌攻毒后上皮淋巴細(xì)胞數(shù)量表現(xiàn)為顯著增加的主要原因。杯狀細(xì)胞是一種典型的糖蛋白分泌細(xì)胞，其分泌的黏蛋白釋放到腸腔后變成潤滑性黏液分布于上皮表面，起到保護(hù)腸黏膜的作用。本試驗用大腸桿菌攻毒后，與不攻毒相比，十二指腸和空腸對照組中的杯狀細(xì)胞表現(xiàn)增加明顯，是機(jī)體腸道黏膜局部細(xì)胞免疫增強(qiáng)的表現(xiàn)形式之一。

在應(yīng)激狀態(tài)下，一些細(xì)胞因子誘導(dǎo)肥大細(xì)胞通過脫顆粒反應(yīng)釋放組胺、白三烯等炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子IL-1、IL-6、INF-γ等[5]，這些介質(zhì)和細(xì)胞因子作用于組織細(xì)胞和趨化細(xì)胞，并誘導(dǎo)這些細(xì)胞大量分泌炎癥因子[6]，放大炎癥反應(yīng)過程，影響腸道屏障功能[7]。本試驗結(jié)果表明在大腸桿菌不攻菌情況下，畢赤酵母甘露寡糖可引起小腸黏膜上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞數(shù)量增加，肥大細(xì)胞數(shù)量降低，說明酵母甘露寡糖可以提高腸黏膜細(xì)胞的免疫力，對外源病原菌起免疫監(jiān)視作用。

4 結(jié)論

試驗表明畢赤酵母甘露寡糖能夠改善大腸桿菌攻毒對仔豬造成生長速度和飼料效率的負(fù)面影響；畢赤酵母甘露寡糖能增加上皮細(xì)胞間淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞數(shù)量，說明畢赤酵母甘露寡糖可以提高腸黏膜細(xì)胞的免疫反應(yīng)。