韓笑，王娜，張玲，李佳

山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟南 250355

金銀花為忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb的干燥花蕾或帶初開的花[1]，富含酚酸類、環(huán)烯醚萜類、黃酮類、糖類揮發(fā)油類及微量元素等多種成分，有抑菌抗炎，抗氧化等多種生理活性，有清熱解毒、治療熱毒血痢、癰疽疔毒的功效[2-3]。由于忍冬繁殖能力強，對土壤和氣候的選擇并不嚴(yán)格，全國各地均有種植，且以河南的“密銀花”和山東的“濟銀花”最為出名。目前在大田生產(chǎn)中主要以扦插和分根繁殖為主。由于近年來金銀花價格走勢不斷上升，運用范圍不斷拓寬，藥農(nóng)對金銀花的關(guān)注度更是增高。植物組織培養(yǎng)是指在無菌環(huán)境下，利用植物離體的細(xì)胞，組織或器官在人工培養(yǎng)的條件下生成新的植物體的過程。組織培養(yǎng)能在較短的時間內(nèi)繁殖出大量的植株，有快速、高效的作用。同時，對于金銀花等容易攜帶病毒，易于退化的植物來說，組織培養(yǎng)可以保持其親本的優(yōu)良性狀，維持良好品質(zhì)[4]。在組織培養(yǎng)過程中，面臨的主要問題之一便是外植體的雜菌感染，如何將外植體進行有效的滅菌，從而得到大批量無菌苗，應(yīng)用于大田生產(chǎn)，得到量大、價低且品質(zhì)好的金銀花品種是我們一直努力的方向。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

金銀花：采于山東中醫(yī)藥大學(xué)藥圃，由山東中醫(yī)藥大學(xué)李佳教授鑒定品種為“金華三號”。

主要試劑：MS干粉培養(yǎng)基，無水乙醇，氯化汞，納米銀(直徑為120 nm)，瓊脂粉，蔗糖，氫氧化鈉，I-BA。

高壓滅菌鍋，超聲波清洗機，PH檢測儀，無菌操作臺。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 取金銀花新生幼嫩莖尖2～3 cm長，用清水浸泡清洗10 min后用吸水紙擦干，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的洗衣粉溶液浸泡20 min后再用清水沖洗30 min，用吸水紙擦干剪掉莖底部變色發(fā)黑部分，處理后長約為2 cm莖尖為備用外植體。

1.2.2 樣品滅菌方式 我們選擇滅菌和抑褐效果較好的乙醇和氯化汞為滅菌劑[5]。

1.2.2.1 堿化乙醇處理 將預(yù)處理后的外植體正交實驗優(yōu)選出實驗方案，將乙醇濃度，氫氧化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)，處理時間和溫度為影響因素，污染率，褐化率和成活率作為評價標(biāo)準(zhǔn)，采用四因素三水平進行比較。正交實驗因素水平表見表1，正交實驗結(jié)果及分析見表2。使用乙醇濃度分別為70%、75%、80%；氫氧化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.5%、1.0%、1.5%；處理時間分別為20、30、40 s；處理溫度分別為20、25、30 ℃。經(jīng)優(yōu)化得到L9(34)的正交試驗。

表1 正交實驗因素水平表

1.2.2.2 氯化汞處理 使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的氯化汞溶液，處理時間分別為5、6、7、8 min。

1.2.2.3 混合處理 A處理：乙醇濃度75%，氫氧化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的堿化乙醇處理30 s+質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%氯化汞7 min。

B處理：直接將備用外植體用無菌水沖洗3遍并用無菌吸水紙擦干后接種到1/2 MS+0.7%瓊脂+3.0%蔗糖+0.1%納米銀+3.0 mg·L-1IBA的培養(yǎng)基上。

C處理：將備用外植體用無菌水沖洗3遍并用無菌吸水紙吸凈水分后接種于1/2 MS+0.7%瓊脂+3.0%蔗糖+3.0 mg·L-1IBA銀的培養(yǎng)基上。

每個處理接種20瓶，重復(fù)三次。

1.2.3 培養(yǎng)基類型 a型：1/2 MS+0.7%瓊脂+3.0%蔗糖+3.0 mg·L-1IBA[6]

b型：1/2 MS+0.7%瓊脂+3.0%蔗糖+0.1%納米銀+3.0 mg·L-1IBA

培養(yǎng)基pH在5.8～6.0之間。

1.2.4 培養(yǎng)環(huán)境 將接種后的外植體置于無菌組織培養(yǎng)室中，溫度25 ℃左右，濕度60%，光照2000 lx，光照時間16 h·d-1。

培養(yǎng)15 d內(nèi)看污染情況，30 d內(nèi)看死亡及褐化情況并及時做好記錄。

(1)

(2)

(3)

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滅菌處理后滅菌效果

2.1.1 堿化乙醇處理效果 由于金銀花外被疏絨毛和疏腺毛，滅菌較為困難。在滅菌劑中加入適量的氫氧化鈉，可增大滅菌劑與金銀花表面的接觸面積，提高滅菌率。

在實驗中我們發(fā)現(xiàn)，乙醇濃度低，滅菌時間短都可能造成滅菌不徹底，污染率就相應(yīng)增高，乙醇濃度過高，滅菌時間增長則使外植體褐化率增高，成活率降低，而氫氧化鈉的濃度過高則過分破壞了金銀花表面，使其褐化率增高。根據(jù)表2可知，處理時間的極差值最高為1.314，為四個因素中最重要因素。本實驗中最適處理時間為30 s。實驗五中氫氧化鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%，處理時間為30 s，乙醇的濃度為75.0%，溫度為25 ℃時外植體污染率和褐化率較低，成活率最高，為最優(yōu)滅菌方法。

實驗結(jié)果=污染率×0.3+褐化率×0.3+成活率×0.4

(4)

表2 堿化乙醇對頂芽滅菌正交實驗安排及結(jié)果

通過表3我們可以看出，處理時間對金銀花外植體滅菌處理結(jié)果的影響達到極顯著水平，乙醇濃度和氫氧化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對金銀花外植體滅菌處理結(jié)果的影響達到顯著水平，溫度對金銀花外植體滅菌處理結(jié)果的影響不顯著。

表3 正交設(shè)計方差分析表

注：*表示P<0.05。

2.1.2 驗證實驗 最佳方案(實驗5)進行三批實驗驗證，得出實驗結(jié)果如表4所示，三次結(jié)果同實驗五結(jié)果比較變動較小，說明結(jié)果穩(wěn)定。

表4 最佳方案驗證實驗

2.1.3 氯化汞處理效果 氯化汞是滅菌效果較強的滅菌劑，滅菌時所需濃度較低。通過表5我們不難發(fā)現(xiàn)，用0.1%的氯化汞處理7 min時，外植體的污染率和褐化率處在一個相對較低的水平，成活率達到88.3%，這一試驗也驗證了文明玲等的研究結(jié)果[7]。且通過表2和表5對比，我們發(fā)現(xiàn)，0.1%的氯化汞滅菌效果遠遠高于乙醇，且對外植體的破壞較小，成活率更高。

表5 氯化汞對頂芽滅菌效果

2.1.4 混合處理滅菌效果 通過表6我們發(fā)現(xiàn)，A處理是將堿化乙醇和氯化汞相結(jié)合進行處理，得到的外植體滅菌效果確實有所增加，但褐化率也有一定程度的上升，我們認(rèn)為，可能是較長時間的試劑處理使外植體外表損壞增大，從而使褐化率增加，成活率有一定的下降。在表六這幾個處理中，不難發(fā)現(xiàn)，B處理是效果最好的處理方式，污染率低至1.7%，褐化率為3.3%，成活率高達96.7%。在B處理過程中，我們最小化的降低對外植體的破壞，只將其外帶的細(xì)菌病毒等殺滅，然后接種于含有納米銀的培養(yǎng)基上，就達到了較好的效果。將B處理與C處理對照，兩者之間差別為是否含納米銀分子，顯而易見，納米銀在抑制雜菌生長方面有著較為顯著地效果。納米銀是直接通過損傷細(xì)菌的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜甚至對細(xì)菌的代謝產(chǎn)生影響來達到抑菌的作用。且納米銀具有無耐藥性，無毒無害，廣泛應(yīng)用于臨床試驗中[8-9]。從C處理中我們也可以發(fā)現(xiàn)，破壞較小的外植體褐化率較低，且其污染率及成活率也是有一定的參考之處。因此筆者認(rèn)為，金銀花外植體含有的成分綠原酸等具有抑菌抗病毒的作用，從而使得金銀花外植體自身產(chǎn)生抵抗外界雜菌病毒的機制，使其污染率到達一個與表2中1號處理幾乎持平的效果。

采用不同濃度，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)、不同處理時間的堿化乙醇滅菌實驗，找到最優(yōu)方案再與氯化汞處理相結(jié)合達到最優(yōu)的滅菌結(jié)果。

表6 混合處理對頂芽的滅菌效果

3 結(jié)論與展望

金銀花外植體滅菌方式多種多樣，外被疏絨毛、疏腺毛等特征，使得滅菌方法與其他植物相比有所不同。試劑處理后最佳滅菌方式為濃度75.0%乙醇與質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%氫氧化鈉混合形成堿化乙醇處理30 s加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%氯化汞處理7 min得到污染率5.0%，成活率88.3%的處理方式。考慮到大田生產(chǎn)的成本問題，0.1%的氯化汞處理7 min則更為合適。同時，本實驗中最優(yōu)滅菌方法為在含有納米銀的b型培養(yǎng)基上接種經(jīng)無菌水沖洗干凈的外植體，可以達到98.7%的滅菌率，96.7%的成活率。

隨著科技的發(fā)展，試驗水平和儀器設(shè)備標(biāo)準(zhǔn)的提升，無菌處理以及組織培養(yǎng)技術(shù)將會達到一個更高的水平。