周心雅，賀稚非,2，王兆明，甘瀟，李洪軍,2*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400716)2(重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶，400716)

兔肉是一種富含蛋白質(zhì)、低脂肪、低膽固醇、低鈉的健康肉品[1]，具有開發(fā)為保健食品的潛力。中國是世界上兔肉產(chǎn)量第一大國，據(jù)FAO的統(tǒng)計，2016年亞洲兔肉產(chǎn)量占世界產(chǎn)量的75.3%，我國的兔肉產(chǎn)量約85萬t[2]。兔肉的市場占有量小[3]，具有廣闊的發(fā)展前景。兔肉的腥味是限制兔肉發(fā)展的一個主要因素。

兔肉腥味是指兔肉加熱后產(chǎn)生的一種令人討厭的氣味。張振華等[4]研究發(fā)現(xiàn)，未去勢公兔的腥味最重，其次是去勢公兔，母兔的腥味最輕。在之后的研究中，姜穎等[5]使用氮氣吹掃-捕集(nitrogen purge-and-trap)技術(shù)提取兔肉腥味物質(zhì)，經(jīng)氣相-質(zhì)譜檢測確認己醛等中級醛為腥味的主體物質(zhì)；謝躍杰等[6]使用超臨界CO2流體萃取兔肉腥味物質(zhì)，確認己酸是另一種腥味主體成分。己醛是一種不飽和ω-6脂肪酸的氧化產(chǎn)物[7]；己酸的來源多樣，包括酶和化學(xué)反應(yīng)，細菌作用，脂類、氨基酸或碳水化合物的分解[8]，同時己酸也可由己醛氧化得到。

冷藏是一種常見的保藏方式。研究表明[9]，在-55 ℃條件下，酶促反應(yīng)、氧化酸敗和冰的再結(jié)晶受到最大限制，肉品很少發(fā)生腐敗。而冷藏在4 ℃環(huán)境下，兔肉易發(fā)生氧化反應(yīng)，腥味物質(zhì)的含量可能發(fā)生變化，影響兔肉的品質(zhì)。本文研究了在4 ℃冷藏條件下，不同部位兔肉腥味物質(zhì)含量的變化規(guī)律，為貯藏期內(nèi)減少兔肉腥味生產(chǎn)高品質(zhì)的兔肉提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料為70日齡的伊拉克公兔，購買于重慶渝北阿興記肉兔養(yǎng)殖基地，按常規(guī)方式統(tǒng)一宰殺后，分割背最長肌、后腿和腹部肌肉，用裝有冰袋的保溫箱運回實驗室，置于4 ℃冰箱貯藏。己酸標準品和己醛標準品為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA323S 電子精密天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；UV-2450 紫外分光光度計，日本島津公司；GC-2010 Plus氣相色譜儀，日本島津公司；HSS 86.50 Plus自動頂空進樣器，意大利DANI Instruments S.p.A.公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 材料處理與試驗設(shè)計

將分割好的兔肉用塑料托盤放置，并使用保鮮膜覆蓋，貯藏于4 ℃的冰箱內(nèi)。分別在0、2、4、6、8、10 d對不同部位的兔肉取樣檢測。分別隨機取背最長肌5條、腹部肌5塊、后腿肌5塊，絞碎后混合取樣，每次測定做3組平行。

1.3.2 揮發(fā)性鹽基氮(total volatile basic nitrogen，TVB-N)的測定

參照GB 5009.228—2016 食品安全國家標準食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定[10]。

1.3.3 硫代巴比妥酸值(thiobarbituric acid-reactive substances，TBARS)的測定

參照GB 5009.181—2016 食品安全國家標準食品中丙二醛的測定[11]。

1.3.4 脂肪氧合酶(lipoxygenase，LOX)活性的測定

參考JIN等[12]的方法并稍作修改。粗酶液的提?。悍Q取5 g絞碎的兔肉，加入3倍體積50 mmol/L pH 7.0 磷酸緩沖液(含有1 mmol/L乙二胺四乙酸和1 mmol/L 二硫蘇糖醇)。在冰浴條件下均質(zhì)4次，每次10 s，25 000 r/min。均質(zhì)后，在4 ℃、12 000 ×g條件下離心60 min，用4層紗布過濾得到上清液，即為LOX酶粗酶液，在4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。底物的配制：?40 mg亞油酸加入5 mL重蒸水和180 μL吐溫-20中，用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH直到溶液變得澄清透明，用重蒸水將溶液定容至50 mL。底物溶液充氮保存在4 ℃冰箱備用。活性的測定：向比色皿加入50 mmol/L pH 5.5 檸檬酸緩沖液2.9 mL，底物溶液200 μL和粗酶液100 μL，蓋上蓋子迅速翻轉(zhuǎn)搖勻，在234 nm下測定1 min內(nèi)吸光度的變化，空白為50 mmol/L pH 5.5 檸檬酸緩沖液3 mL和粗酶液100 μL。 在234 nm下，每分鐘每克蛋白增加的1個吸光度單位定義為1個酶活單位。

1.3.5 己醛和己酸含量的測定

使用靜態(tài)頂空—氣相色譜法測定己醛和己酸的含量。參考鄧大川等[13]的方法并稍作修改。

樣品的制備：取2.00 g絞碎兔肉加入20 mL頂空瓶中，加入2 mL飽和食鹽水，封蓋后輕輕振蕩搖勻。在70 ℃下靜態(tài)頂空保溫20 min進樣，定量管溫度130 ℃，傳輸線溫度150 ℃。

氣相色譜條件：色譜柱：Rtx-Wax (30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度250 ℃；升溫程序：40 ℃保持3 min，以20 ℃/min升至115 ℃，再以6 ℃/min升至180 ℃(保持3 min)，最后以20 ℃/min升至230 ℃ (保持3 min)；柱流量為1.5 mL/min，流速1.06 mL/min， 載氣為N2；自動頂空進樣器進樣，分流比10∶1。使用外標法計算物質(zhì)的含量。

1.3.6 氣味活度值(OAV)分析法

采用OAV法評價風(fēng)味物質(zhì)對整體風(fēng)味的貢獻大小。OAV>1，認定該化合物對整體風(fēng)味有貢獻；OAV≤1，認定該化合物對整體風(fēng)味沒有貢獻，OAV值越大則化合物對整體風(fēng)味的貢獻越大。計算公式(1)如下：

(1)

式中：C為化合物濃度；T為感覺閾值。

1.4 統(tǒng)計分析

試驗重復(fù)3次測定，所得數(shù)據(jù)使用Excel 2013計算平均值和標準偏差，圖形繪制使用Origin 2017，SPSS Statistics 19.0統(tǒng)計軟件進行差異顯著性分析，取95%置信度(P<0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 貯藏期兔肉新鮮度的變化

TVB-N的主要成分是氨、伯胺、仲胺和叔胺，它主要是由肉類貯藏過程中的腐敗菌或酶降解產(chǎn)生的[14]。隨著細菌消耗肌肉中的糖原和肌肉蛋白質(zhì)的降解，TVB-N相應(yīng)的積累呈現(xiàn)出上升趨勢。TVB-N含量的變化常用于評價肉品的新鮮程度，隨著TVB-N含量的增長，兔肉新鮮程度下降。由圖1可知，在貯藏期內(nèi)3個部位的兔肉的TVB-N含量顯著上升，后腿肌、背最長肌和腹肌的初始值分別為9.91 mg/100 g、10.83 mg/100g、9.59 mg/100g。根據(jù)GB 2707—2016[15]的規(guī)定，鮮肉的TVB-N含量應(yīng)≤15 mg/100 g。后腿和腹部在2 d時接近臨界值，分別為14.9 mg/100 g和14.64 mg/100 g，而背最長肌在4 d時才接近臨界值，為14.46 mg/100g。與后腿和腹部相比，背部肌肉的腐敗速度較緩，且從2 d開始TVB-N含量始終小于其余2個部位。結(jié)果表明，在4 ℃貯藏條件下，兔肉極易發(fā)生腐敗變質(zhì)。

圖1 貯藏過程中不同部位兔肉TVB-N含量的變化Fig.1 The change of TVB-N of different parts from rabbit during storage注：圖中大寫字母為組間差異顯著性比較，小寫字母為組內(nèi)差異顯著性比較。

2.2 貯藏期兔肉脂肪氧化的變化

TBARS值被廣泛運用于評價脂質(zhì)氧化程度。圖2反應(yīng)了兔肉不同部位在貯藏期的脂質(zhì)氧化程度，由圖2可知，3個部位在貯藏期脂質(zhì)氧化程度顯著上升(P<0.05)， 在貯藏終點，背最長肌、后腿肌和腹肌分別達到0.71 mg/kg、0.68 mg/kg、0.76 mg/kg，三者存在顯著差異(P<0.05)。在相同貯藏條件下，背最長肌在分割后僅剩單面肌膜，與結(jié)構(gòu)完整的后腿肌相比與環(huán)境接觸面積更大，更容易發(fā)生脂質(zhì)氧化[16]。汪踔等[17]發(fā)現(xiàn)，60日齡的四川白兔腹肌脂肪含量高于背最長肌和后腿肌，這可能導(dǎo)致腹肌的脂肪氧化程度比其余2個部位更劇烈。

圖2 貯藏過程中不同部位兔肉TBARS值的變化Fig.2 The change of TBARS value of different parts from rabbit during storage注：圖中大寫字母為組間差異顯著性比較，小寫字母為組內(nèi)差異顯著性比較。

2.3 貯藏期兔肉LOX酶活性的變化

LOX酶是一種含鐵的雙加氧酶，它能催化氧化含有順，順-1,4-戊二烯基的多不飽和脂肪酸，生成具有共軛雙鍵的氫過氧化物[18]。氫過氧化物分解能產(chǎn)生醛、酮、酸、醇等小分子物質(zhì)，使食品具有令人不愉快的氣味。由圖3可知，兔肉中不同部位的LOX酶活性在貯藏期均出現(xiàn)先增大再減小的趨勢，后腿肌和背最長肌在2 d時酶活性最大，而腹肌的峰值出現(xiàn)在4 d。

圖3 貯藏過程中不同部位兔肉LOX酶活性的變化Fig.3 The change of LOX activity of different parts from rabbit during storage注：圖中大寫字母為組間差異顯著性比較，小寫字母為組內(nèi)差異顯著性比較。

這可能與貯藏期兔肉pH值的變化相關(guān)，熊國遠等[19]研究發(fā)現(xiàn)，兔肉在貯藏期pH值先增大再減小，過高的pH抑制了酶的活性。劉奇[20]測定鱘魚的不同部位的LOX酶活性，在貯藏期表現(xiàn)出與本研究相同的趨勢。腹肌在0～4 d酶活性出現(xiàn)陡增，4 d 時超過背最長肌和后腿肌，而背最長肌的酶活性始終小于后腿肌且二者存在相似的變化趨勢。兔肉的腥味物質(zhì)己醛的產(chǎn)生也與LOX酶相關(guān)，酶活性的變化與己醛含量的變化存在一定聯(lián)系。

2.4 貯藏期兔肉腥味物質(zhì)的變化

己醛由不飽和脂肪酸分解產(chǎn)生，被描述為青草味，其含量的變化常作為食品脂質(zhì)氧化程度的監(jiān)測指標，在短期貯藏(0～6 d)時，己醛可以作為肉品風(fēng)味惡化的主要指標[21]。由表1可知，腹肌己醛含量呈波動式增長，其含量的增長與脂肪酸的氧化有關(guān)。

表1 貯藏過程中不同部位兔肉己醛含量的變化及OAV分析Table 1 The change of hexanal content and OAV of different parts from rabbit during storage

注：己醛含量用平均值±標準偏差表示，上標字母為同組內(nèi)差異顯著性比較，己醛閾值[23]為4.5 ng/g。

后期的下降可能是由于己醛聚合成具有強烈臭味的環(huán)狀三聚物——三戊基三噁烷[22]導(dǎo)致的，這與貯藏后期能聞到明顯臭味的現(xiàn)象一致。此外，己醛氧化形成己酸也能導(dǎo)致其含量的減少。背最長肌和后腿肌的己醛含量雖然也有先增長再下降的趨勢，但變化幅度相對較小。在整個貯藏期，腹肌的己醛含量始終高于其余2個部位，上述現(xiàn)象可能與不同部位的脂質(zhì)含量有關(guān)。

己酸是一種短鏈脂肪酸，被描述為羊膻味，在新鮮的鴨肉[24]和牛肉[8]中均存在。由表2可以看出，背最長肌和腹肌的己酸含量在貯藏期內(nèi)整體上呈先下降再上升的趨勢，含量減少的原因不明，后期的增長可能是由于肉品腐敗微生物污染造成的，此外己醛被氧化也能生成己酸，這與上述己醛含量的下降相符。后腿肌的初始己酸含量最低為3.00 ng/g，貯藏終點時為5.91 ng/g顯著高于初始(P<0.05)。比較貯藏期內(nèi)己酸和己醛的OAV值可知，己酸對腥味的貢獻大于己醛。由表1和表2可知，相較于己醛，己酸的波動范圍較廣，含量受貯藏時間的影響更大。

表2 貯藏過程中不同部位兔肉己酸含量的變化及OAV分析Table 2 The change of hexanoic acid content and OAV of different parts from rabbit during storage

注：己酸含量用平均值±標準偏差表示，上標字母為同組內(nèi)差異顯著性比較，己酸閾值[25]為1.1 ng/g。

3 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，在4 ℃貯藏條件下，隨著兔肉的腐敗加深，兔肉脂質(zhì)氧化加劇，腥味物質(zhì)己酸的含量出現(xiàn)先下降再上升的趨勢，而另一種腥味物質(zhì)己醛的含量較穩(wěn)定，在一個小范圍內(nèi)波動。LOX酶活性在貯藏期呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢，酶活變化的主要原因是兔肉pH的變化，溫度對酶的抑制作用較小。兔肉在貯藏期內(nèi)腥味物質(zhì)的變化規(guī)律可以為提高兔肉品質(zhì)提供理論依據(jù)。在本研究中，己醛的含量沒有隨脂質(zhì)氧化的加劇而不停增長，這與其他文獻報道不同，可以進行更深入的研究。