劉倩倩，李俊薇，曹潤(rùn)潔，張會(huì)敏,何宏魁*，李安軍，張治洲*

1(哈爾濱工業(yè)大學(xué)(威海) 海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,山東 威海,264209)2(安徽古井貢酒股份有限公司,安徽 毫州,236800)

白酒是我國(guó)傳統(tǒng)的發(fā)酵食品，有著悠久的歷史，從古至今一直備受青睞[1]。中國(guó)傳統(tǒng)白酒是以富含淀粉質(zhì)的糧谷類為原料，以酒曲為糖化劑，采用固態(tài)、半固態(tài)或液態(tài)發(fā)酵，經(jīng)蒸餾、貯存和勾調(diào)而成的乙醇飲料[2]。由于白酒的釀造廠區(qū)建設(shè)時(shí)間以及地域的差異，不同窖池中酸類物質(zhì)組成成分和含量有較大差異[3]，其中乳酸桿菌(Lactobacillus)的含量在新窖池和老窖池之間存在較大差異[3-5]；該菌屬的含量超過(guò)一定閾值后將嚴(yán)重影響酒質(zhì)[6]。在濃香型白酒領(lǐng)域，乳酸桿菌及其具體系列物種的生物學(xué)功能、尤其是其在固態(tài)發(fā)酵各個(gè)階段中的具體功能，尚未得到充分的探索。

在白酒生產(chǎn)中，乳酸菌在白酒口味及香味上發(fā)揮很重要的作用。乳酸菌能發(fā)酵糖類生成乳酸，在酒醅內(nèi)通過(guò)酯化作用產(chǎn)生乳酸乙酯，乳酸乙酯被蒸入酒中，使白酒具有獨(dú)特的香味[7]。乳酸桿菌也是窖泥中主要的微生物之一，往往與丁酸菌、己酸菌、甲烷菌、硫酸鹽還原菌、硝酸鹽還原菌等菌類共存“共生”，當(dāng)乳酸菌混入入窖的料醅后，會(huì)爭(zhēng)奪葡萄糖等糖類物質(zhì)為發(fā)酵原料而生成乳酸。有的乳酸菌還同時(shí)生成少量的乙酸、乙醇、丙酸、丁酸、丙酮酸等物質(zhì)[8]，共同調(diào)節(jié)酒體風(fēng)味。在酒類發(fā)酵過(guò)程中由于酒精含量等環(huán)境壓力使微生物的生長(zhǎng)受限，少數(shù)種類的細(xì)菌在這種條件下保持活力，可能被認(rèn)定為酒類腐敗微生物。L.acetotocerans被證實(shí)是一種培養(yǎng)較困難，且經(jīng)常出現(xiàn)在中國(guó)南方的釀酒廠中的一種微生物；它具有產(chǎn)生乳酸的能力[9]。一方面，白酒的生產(chǎn)需要適量的乳酸；另一方面，這種菌含量過(guò)多時(shí)帶來(lái)的綜合效果嚴(yán)重影響酒類口感[6]。啤酒類發(fā)酵對(duì)于該菌的研究也不在少數(shù)，乳酸桿菌是啤酒發(fā)酵過(guò)程中常見的菌種[10-11]。我國(guó)四川理工學(xué)院四川省釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室通過(guò)對(duì)四川某濃香型白酒股份有限公司20年窖齡的窖池上、中、下取樣后分析得到，其中優(yōu)勢(shì)菌群Clostridiumdiolis及Lactobacillusacetotolerans在上、中、下層窖泥中所占比例分別為34.9%和39.8%、25.2%和20.6%以及23.8%和36.6%[12]。2015年Elsevier B.V.公司發(fā)表了一篇文章[13]，從日本清酒中分離出LactobacillusacetotoleransRIB 9124 (NBRC 13120)株菌，在這篇報(bào)道中首次公開了L.acetotoleransstrain的全基因組序列，并對(duì)其進(jìn)行命名[9]。該文章公開的L.acetotocerans全基因組序列為本實(shí)驗(yàn)中物種特異性引物設(shè)計(jì)奠定了基礎(chǔ)。

根據(jù)古井貢酒窖泥和酒醅樣本中已獲悉的菌群信息[14-18]，我們發(fā)現(xiàn)其中L.acetotocerans在酒醅中占主導(dǎo)地位，含量非常高，且明顯高于窖泥中L.acetotocerans的含量。國(guó)內(nèi)外對(duì)該乳酸桿菌的研究已經(jīng)很多，主要針對(duì)微生物的功能性研究，而通過(guò)特異性引物對(duì)該菌含量的快速檢測(cè)方法報(bào)道非常少。另外，數(shù)據(jù)庫(kù)中顯示Lactobacillus這個(gè)屬不同的物種已經(jīng)有70多個(gè)基因組全序列，這為本研究中設(shè)計(jì)L.acetotocerans的物種特異性引物提供了更多的背景信息，而PRIMER-BLAST這個(gè)引物設(shè)計(jì)平臺(tái)可以把這70多個(gè)全基因組全部考慮進(jìn)去，這樣設(shè)計(jì)的引物就會(huì)有更好的特異性，可以用于窖泥酒醅等發(fā)酵樣本中L.acetotocerans含量的快速測(cè)定，其數(shù)據(jù)可為窖泥等釀酒樣本質(zhì)量評(píng)估提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

該試驗(yàn)涉及的材料取自安徽省亳州市古井貢酒公司不同等級(jí)窖池的12個(gè)窖泥樣本和12個(gè)酒醅樣本。

利用基因組提取試劑盒提取上述樣本的宏基因組以及純菌種的基因組?；蚪MDNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度后統(tǒng)一稀釋為10 ng/μL用作PCR的模板以及QPCR的定量模板。

所用的純菌菌種均購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)。

Step-One Real-Time PCR系統(tǒng)(QPCR)、HC-3018R高速冷凍離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；JY-300C電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；WD-9413凝膠成像儀，北京六一儀器廠；TP600(TaKaRa)Q-PCR儀、Ezup柱式基因組提取試劑盒(B518251)，上海生工；NPK02、NPK62 PCR試劑盒，威海曉東生物；pMD19-T kit TA克隆試劑盒，Takara。

1.2 利用Primer-Blast設(shè)計(jì)特異性引物

檢索EBI中Genome數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ebi.ac.uk/genomes/)，檢索到70個(gè)除L.acetotocerans外的乳桿菌菌種，表1用作引物設(shè)計(jì)的背景序列，利用Primer-Blast[19]對(duì)L.acetotocerans的全基因組序列設(shè)計(jì)物種特異性引物，并用Blast對(duì)已設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行驗(yàn)證，篩選出2對(duì)優(yōu)質(zhì)引物。設(shè)計(jì)L.acetotocerans物種的特異性引物的目的一般基于兩個(gè)，一是鑒定該物種，以及檢測(cè)某一生物群落中是否包含該物種，二是確定該物種在整個(gè)微生物群落中的豐度[20-22]。

表1 EBI數(shù)據(jù)庫(kù)中71個(gè)有全基因組序列的乳酸桿菌菌株信息Table 1 71 Lactobacillus strains with whole genome sequences found in the EBI database

1.3 利用普通PCR檢測(cè)引物特異性

利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)對(duì)兩對(duì)引物的特異性進(jìn)行驗(yàn)證。分別采用12個(gè)窖泥基因組、12個(gè)酒醅基因組DNA作為實(shí)驗(yàn)?zāi)０澹?PCR反應(yīng)體系為：NPK02 buffer(2×) 6 μL,物種特異性引物L(fēng)A2(LA3)1.5 μL，模板0.5 μL,Taq酶0.3 μL，ddH2O 3.7 μL。PCR循環(huán)參數(shù)：94 ℃、4 min； 94 ℃、30 s，60 ℃(引物L(fēng)A2) 或63 ℃(引物L(fēng)A3)40 s， 72 ℃、40 s，37個(gè)循環(huán)；72 ℃, 2 min。取8 μL 反應(yīng)液進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠(120V，20 min)電泳。

1.4 利用PCR產(chǎn)物測(cè)序進(jìn)行引物特異性評(píng)估

上述PCR產(chǎn)物可以直接用于TA克隆。pMD19-T載體 0.3 μL，LA2(或LA3)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物0.5 μL，滅菌ddH2O 4.2 μL，Solution I 5 μL，混勻，室溫連接1小時(shí)后放入冰浴，加入冰冷的30 μL大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α并混勻，冰浴放置40 min。再加入1 mL普通LB培養(yǎng)基溶液，于37 ℃恒溫振蕩器中培養(yǎng)活化1 h。將X-gal 40 μL(10 mg/mL)，IPTG 40 μL(10 mg/mL)， 160 μL dH2O混勻，涂布于LBA固體培養(yǎng)基，待其干燥，將活化的菌液200 μL繼續(xù)涂布于X-gal和IPTG干燥后的LBA固體培養(yǎng)基上。37 ℃ 恒溫過(guò)夜培養(yǎng)。篩選單克隆(圖1)。將篩選的單克隆37 ℃恒溫過(guò)夜培養(yǎng)后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行單菌落測(cè)序。利用NCBI網(wǎng)站的BLAST工具，比對(duì)測(cè)序結(jié)果，根據(jù)測(cè)序結(jié)果鑒定篩選的單克隆是否含有L.acetotolerans的特異性DNA序列。

A-LA2;B-LA3圖1 利用兩對(duì)引物L(fēng)A2和LA3擴(kuò)增產(chǎn)物得到的TA克隆Fig.1 TA clones of PCR amplicons by primer pair LA2 and LA3

1.5 利用純Lactobacillus菌株驗(yàn)證L. acetotolerans引物特異性

涉及到的純菌株為:(P1)耐酸乳桿菌Lactobacillusacetotolerans(實(shí)驗(yàn)室自備)；(P2)植物乳桿菌Lactobacillusplantarum(CICC20265)；(P3)發(fā)酵乳桿菌Lactobacillusfermentum(CICC22808)；(P4)干酪乳桿菌Lactobacilluscasei(1.320 6)；(P5)嗜酸乳桿菌Lactobacillusacidophilus(1.334 2)；(P6)德式乳桿菌乳亞種Lactobacillusdelbrueckiisubsp. Lactis(1.262 5)。

1.6 QPCR測(cè)定

使用篩選出來(lái)的兩對(duì)特異性引物對(duì)12個(gè)窖泥樣本和12個(gè)酒醅樣本基因組DNA做QPCR定量實(shí)驗(yàn)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線、熔解曲線、指數(shù)增長(zhǎng)曲線，以及copy數(shù)計(jì)算來(lái)對(duì)L.acetotolerans的含量做初步檢測(cè)及綜合質(zhì)量評(píng)估。以用于測(cè)序的PCR純化產(chǎn)物連續(xù)稀釋10倍作為標(biāo)準(zhǔn)。陰性對(duì)照、每個(gè)用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)樣本以及待測(cè)樣本均重復(fù)3次。使用的PCR擴(kuò)增體系為NPK62(含熒光染料)6 μL，特異性引物1.5 μL，Taq酶0.25 μL，基因組模板4.25 μL。QPCR條件為94 ℃,4 min (94 ℃,30 s;57 ℃,40 s;72 ℃,40 s)，42個(gè)循環(huán)，72 ℃,2 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物設(shè)計(jì)與分析

通過(guò)對(duì)L.acetotolerans全基因組進(jìn)行物種特異性引物設(shè)計(jì)，在1435181處設(shè)計(jì)上游引物L(fēng)A2F：5′-GTG CAG CTT AAG GGC TTC CT-3′(20 bp)，在1435320處設(shè)計(jì)下游引物L(fēng)A2R：5′- ATC TGT GCA GAT TGT TCC CTT-3′(21bp)，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度194 bp；在1702025處設(shè)計(jì)上游引物L(fēng)A3F：5′- AGA GTG TCC CGA GTA GTC CC-3′(20bp)，在1702133處設(shè)計(jì)下游引物L(fēng)A3R：5′- AAC TGC TCA AGA AGG GAC CG-3′(20bp)，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為150 bp。

2.2 PCR擴(kuò)增兼TA克隆/測(cè)序鑒定引物特異性

使用TA克隆技術(shù)手段對(duì)古井實(shí)際樣本做了特異性引物驗(yàn)證并挑選陽(yáng)性克隆，并對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行單菌落測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如表2、表3所示。結(jié)果顯示，對(duì)LA215個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，克隆序列均為目標(biāo)序列，有效序列的成功率為100%；對(duì)LA314個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，克隆序列均為目標(biāo)序列，有效序列的成功率也是100%。

2.3 利用乳桿菌純菌株進(jìn)一步驗(yàn)證引物特異性

以LA2、LA3這兩對(duì)物種特異性引物分別對(duì)上述6株乳酸桿菌純菌基因組(樣本順序依次為A，B，C，D，E，F(xiàn))進(jìn)行PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖2，兩對(duì)引物均只從P1樣本(L.acetotolerans)中擴(kuò)增出來(lái)目的條帶，說(shuō)明引物的特異性較好。

表2 引物L(fēng)A2 TA克隆Blast結(jié)果Table 2 Primer LA2 TA cloning blast results

表3 引物L(fēng)A3 TA克隆Blast結(jié)果Table 3 Primer LA3 TA clone Blast results

圖2 L.a菌特異性引物L(fēng)A2(A)和LA3(B)對(duì)6株乳酸桿菌純菌基因組的PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)Fig.2 PCR amplification using L.a-specific primer LA2 (A) orLA3 (B) and genomic DNA of 6 pure Lactobacillus strains注：M-DL2000 DNA marker (2 000, 1 000, 750,500,250和100 bp)，圖3同。

2.4 使用2對(duì)特異性引物對(duì)窖泥和酒醅中L.acetotolerans進(jìn)行檢測(cè)

PCR擴(kuò)增結(jié)果(圖3)顯示，在相同的擴(kuò)增條件下(其中PCR熱循環(huán)數(shù)為37)，普通窖泥的條帶較優(yōu)質(zhì)窖泥更清晰明亮，普通酒醅的條帶較優(yōu)質(zhì)酒醅更清晰明亮，酒醅條帶較窖泥更清晰明亮，與理論預(yù)期一致。

A-窖泥樣品LA3；B-窖泥樣品LA2；C-酒醅樣品LA3；D-酒醅樣品LA2圖3 兩對(duì)引物的普通PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR results of two pairs of primers注：A、B代表老窖池，C代表新窖池;N代表窖泥樣，P代表酒醅樣本。

結(jié)果為酒醅中該菌含量明顯多于窖泥，普通酒醅中該菌含量明顯多于優(yōu)質(zhì)酒醅，普通窖泥中該菌含量明顯多于優(yōu)質(zhì)窖泥。在循環(huán)數(shù)較小的前提下，使用普通PCR可以對(duì)樣本中的L.acetotolerans含量進(jìn)行半定量。

2.5 利用QPCR定量比較樣本中L.acetotolerans含量的相對(duì)多寡

作為兩對(duì)引物在古井發(fā)酵樣本質(zhì)量評(píng)估中的初步應(yīng)用，將古井貢酒12個(gè)窖泥樣本和12個(gè)酒醅樣本進(jìn)行QPCR實(shí)驗(yàn)，以此來(lái)對(duì)窖泥和酒醅樣本中L.acetotolerans的含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示。熔解曲線(未提供)均為比較集中接近的單峰，說(shuō)明這兩對(duì)引物特異性符合QPCR的定量要求。兩對(duì)引物的定量結(jié)果總體趨勢(shì)一致，即酒醅中L.acetotolerans的相對(duì)含量明顯高于窖泥，尤其是遠(yuǎn)高于老窖泥。

圖4 利用兩對(duì)引物和QPCR測(cè)定12個(gè)窖泥樣本和12個(gè)酒醅樣本中菌的(相對(duì))含量Fig.4 QPCR quantification results of L. acetotoleransin 12 pitmud and 12 Zaopei samples

3 討論

目前，窖泥的質(zhì)量評(píng)估主要根據(jù)其色澤、氣味、手感以及質(zhì)地等感官特征為判別的重要指標(biāo)[23]，如優(yōu)質(zhì)老窖窖泥質(zhì)感細(xì)膩，氣味濃郁芳香，老化窖泥則較為干燥，容易板結(jié)成塊，無(wú)芳香氣味[24]。理化指標(biāo)和菌群指標(biāo)都可以用來(lái)衡量窖泥、醩醅等發(fā)酵樣本的質(zhì)量特征，以避免使用感官特征對(duì)窖泥進(jìn)行實(shí)時(shí)評(píng)估與檢測(cè)所對(duì)應(yīng)的局限性。目前可以檢測(cè)菌群特征的技術(shù)非常多，比如PCR-SSCP法可對(duì)窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析[25]。通過(guò)檢測(cè)單一菌種來(lái)輔助判斷發(fā)酵樣本的質(zhì)量好壞也是一種重要的方法，比如徐巖等設(shè)計(jì)了特異性引物可以對(duì)發(fā)酵食品中耐酸乳桿菌進(jìn)行定性定量[26]，但是其設(shè)計(jì)的引物與本研究設(shè)計(jì)的引物在序列內(nèi)容和在L.acetotolerans基因組中的位置均不同。

本文中的QPCR測(cè)定結(jié)果表明老窖泥中L.acetotolerans的含量明顯低于新窖泥，但是不是絕對(duì)的。個(gè)別新窖池的窖泥也具有很低的含量，原因尚不清楚，需要進(jìn)一步觀察研究。但是如果L.acetotolerans在窖泥中的含量很高則肯定不是老窖泥。圖3中的NC3樣本(新窖池窖泥樣本)使用兩個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增的結(jié)果都很低，但是應(yīng)該不是取樣誤差帶來(lái)的問(wèn)題，因?yàn)槊恳粋€(gè)窖泥樣本都是一個(gè)窖池內(nèi)進(jìn)行9點(diǎn)等量取樣后再等量均勻混合得到的混合樣本[5]。另外，個(gè)別酒醅樣本利用LA2引物對(duì)測(cè)定的L.acetotolerans含量也較低，但是使用LA3測(cè)定的結(jié)果很高(如PC1樣本)。不過(guò)這些不一致暫時(shí)還說(shuō)明不了LA2和LA3引物對(duì)到底哪個(gè)定量更準(zhǔn)確，可以在使用的過(guò)程中逐步確定最佳的定量引物。

高通量測(cè)序結(jié)果顯示[3]，古井貢酒酒醅中至少含有49種不同的乳酸桿菌(Lactobacillus),它們中間85%以上都是L.acetotolerans。酒醅中如此分布的乳酸桿菌(Lactobacullus)之間如何相互作用是一個(gè)很有趣的問(wèn)題，值得研究人員思索和探究。其他種類的乳酸桿菌也可以使用相同的方法設(shè)計(jì)物種特異性引物并測(cè)定各自在發(fā)酵過(guò)程中的含量變化。本研究設(shè)計(jì)的引物以71種不同的乳酸桿菌基因組為背景，所以本文中的兩對(duì)引物測(cè)定的絕大部分只是L.acetotolerans的含量，基本不包含其他乳酸桿菌的含量信息。

本研究中使用的12個(gè)窖池的出酒質(zhì)量都經(jīng)過(guò)仔細(xì)的品評(píng)和香味成分分析[3]。白酒的質(zhì)量總體上是B廠區(qū)(百年窖池)好于A廠區(qū)(40年窖池)，C廠區(qū)屬于新廠區(qū)，出酒質(zhì)量排在最后?？傮w來(lái)講，窖泥中耐酸乳酸桿菌的含量與白酒品質(zhì)存在明確的負(fù)相關(guān)關(guān)系。而酒醅中L.acetotolerans的含量與酒體質(zhì)量之間的關(guān)系尚未見明顯的規(guī)律。C廠區(qū)不同池子的窖泥中L.acetotolerans的含量差異與酒體質(zhì)量并不完全對(duì)應(yīng)，提示新廠區(qū)的窖池整體菌群尚處于調(diào)整階段，菌群結(jié)構(gòu)上不像老廠區(qū)那樣穩(wěn)定。這一點(diǎn)可能反映在L.acetotolerans含量的波動(dòng)上。

徐巖等申報(bào)的專利[26]提供了一對(duì)L.acetotolerans的特異性引物，其設(shè)計(jì)方法的特異性驗(yàn)證手段與本文類似。從其專利公開的數(shù)據(jù)來(lái)看，引物的特異性和QPCR定量效果都非常好。但是本文并沒(méi)有比較他們的這對(duì)引物與本文中2對(duì)引物在測(cè)定24個(gè)樣本中的特異性差異和QPCR定量結(jié)果差異。主要原因在于，不同白酒的不同發(fā)酵樣本中菌群的組成差異較大，L.acetotolerans的幾對(duì)引物面向不同的樣本中菌群基因組背景差異很大時(shí)，各自表現(xiàn)出來(lái)的物種特異性程度肯定是不同的?；蛘哒f(shuō)，到底哪一對(duì)引物的物種特異性最好取決于使用的具體的樣本，研究人員需要在實(shí)際的測(cè)試過(guò)程中找到適合所用樣本的最佳引物。