李雪晗,郭婷,2,余永,2,張宇昊,2*
1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院,重慶,400715)2(西南大學(xué),國(guó)家食品科學(xué)與工程實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心,重慶,400715)
明膠由動(dòng)物皮膚、骨、肌膜、肌腱等結(jié)締組織中的膠原部分降解而成,屬于大分子的親水膠體,可溶于熱水,可形成熱可逆性凝膠。明膠作為食品添加劑廣泛應(yīng)用到各類(lèi)食品之中,如可添加到酒類(lèi)中作為澄清劑、可添加到肉制品中作為增稠劑和膠凝劑、亦可添加到分散體系中作為穩(wěn)定劑[1]。食品體系中的電解質(zhì)、酸堿性、糖類(lèi)物質(zhì)及外源物理處理如紫外照射、微波等均會(huì)影響明膠的黏度、凝凍強(qiáng)度和透射比[2]。
近年來(lái),超聲波技術(shù)作為一種高速發(fā)展的新興技術(shù),被各個(gè)領(lǐng)域所廣泛應(yīng)用。在食品加工過(guò)程中,超聲波技術(shù)主要應(yīng)用于食品加工的單一過(guò)程,例如在食品無(wú)損檢測(cè)及保鮮、乳液的乳化和均質(zhì)、超聲輔助完成的提取干燥殺菌過(guò)濾、肉的嫩化等方面[3-6]。巴西圣保羅大學(xué)的LUIS等[7]研究發(fā)現(xiàn)超聲處理增加了重組熟制火腿的紅度值,并導(dǎo)致了肌原纖維產(chǎn)生微裂紋,并由此推斷超聲波在生產(chǎn)更健康的肉制品方面具有良好的潛力。此外,超聲波技術(shù)在蛋白質(zhì)改性方面也有較為普遍的應(yīng)用,其主要研究方向關(guān)于蛋白質(zhì)的水合作用、結(jié)構(gòu)變化以及加工特性。MADADLOU等[8]研究發(fā)現(xiàn),酪蛋白溶液經(jīng)過(guò)超聲處理后,形成凝膠的pH值降低,凝膠的彈性和強(qiáng)度增強(qiáng)。超聲處理可以增加蛋白溶解性,提高其乳化性,改善流變性能[9-10]。
由此可見(jiàn)不同的超聲處理可以改變蛋白的性質(zhì),目前超聲波技術(shù)對(duì)明膠理化性質(zhì)與功能特性的影響尚缺乏系統(tǒng)的研究,本實(shí)驗(yàn)以豬皮明膠為原料,系統(tǒng)研究不同條件下超聲處理對(duì)明膠性質(zhì)影響規(guī)律,并結(jié)合明膠分子結(jié)構(gòu)的影響,分析超聲影響明膠性質(zhì)的分子機(jī)制,旨在為超聲波技術(shù)在含有明膠的食品體系中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
豬皮明膠(gelatin from porcine skin,V900863-500G),西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。
電子天平(JA3003B),上海精天電子儀器有限公司;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(101-4-S),上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;溫控水浴鍋(8002),北京永光明醫(yī)療儀器廠;質(zhì)構(gòu)儀(CT-3),美國(guó)博勒飛公司;基礎(chǔ)電泳儀(Power Pac TM),美國(guó)Bio-Rad公司;紅外光譜儀(Spectrun100),美國(guó)Perkin Elmer公司;超聲波細(xì)胞破碎儀(JY92-IIDN型),寧波新芝生物科技股份有限公司;流變儀(DHR-1),美國(guó)TA公司。
1.3.1 明膠的超聲處理
配制66.7 g/L的明膠溶液30 mL,在60 ℃的恒溫水浴鍋中充分溶解后,快速放置于超聲波細(xì)胞粉碎儀中超聲處理,超聲處理基礎(chǔ)條件為超聲功率400 W,超聲時(shí)間10 min,超聲功率水平設(shè)置為為200、400、600 W,超聲時(shí)間水平設(shè)置為1、5、10、20 min 的12組實(shí)驗(yàn),每組實(shí)驗(yàn)做3組平行。將做好的樣品60 ℃熱風(fēng)干燥24 h后放于干燥皿中保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.2 明膠強(qiáng)度分析
將樣品配成66.7 g/L的溶液,所得溶液放置于4 ℃的冰箱18 h后取出,立即采用質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定其凝膠強(qiáng)度。測(cè)定參數(shù)為:探頭TA5,測(cè)試類(lèi)型TPA分析,測(cè)試目標(biāo)為距離4 mm,觸發(fā)點(diǎn)負(fù)載5 g,測(cè)試速度1 mm/s。
1.3.3 明膠的亞基組成分析
采用SDS-PAGE垂直電泳分析明膠的亞基組成和分子質(zhì)量分布。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的分離膠,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的濃縮膠;電泳緩沖液為10×Tris-Glycine緩沖液(含0.25 mol/L Tris、1.92 mol/L Glycine、10 g/L SDS,稀釋10倍作內(nèi)槽電泳液);5×樣品緩沖液(含250 mmol/L Tris-HCl(pH值6.8)、0.1 g/mL SDS、5 mg/mL BPB、0.5 mL/mL甘油、0.05 mL/mL 2-ME);考馬斯亮藍(lán)R-250染色液(含1 g/L考馬斯亮藍(lán)R-250、 250 mL/L異丙醇、100 mL/L冰乙酸)和考馬斯亮藍(lán)染色脫色液(含100 mL/L冰乙酸、50 mL/L乙醇)。配制1.5 mg/mL的明膠溶液,按體積比4∶1添加5×樣品緩沖液,沸水浴,冷卻后上樣,上樣量為10 μL(marker上樣量為10 μL)。15 mA恒流電泳,待溴酚藍(lán)跑到分離膠中后,電流調(diào)至25 mA,電泳時(shí)間約1 h。 考馬斯亮藍(lán)染色后用脫色液脫色,多次更換脫色液直至背景脫凈。
1.3.4 流變特性分析
分別測(cè)定超聲處理前后明膠黏度、膠凝溫度和熔化溫度、儲(chǔ)能模量與損耗模量。
(1)明膠黏度特性分析
釆用DHR-1流變儀測(cè)定66.7 g/L的明膠溶液在40 ℃下黏度隨剪切速率的變化。
(2)明膠膠凝溫度和熔化溫度分析
釆用動(dòng)態(tài)黏彈性法測(cè)定明膠的膠凝溫度和熔化溫度,以tan(d)=1作為膠凝和熔化的轉(zhuǎn)折點(diǎn),定義其對(duì)應(yīng)的溫度為膠凝/熔化溫度。采用DHR-1流變儀測(cè)定6.67%的經(jīng)超聲處理的明膠樣品的黏彈性,設(shè)定溫度變化速率為1 ℃/min,控制應(yīng)力3.0 Pa,測(cè)試夾具40 mm A1平板,Peltier溫度控制系統(tǒng),板間距為0.15 mm,明膠樣品溶化后于流變儀上溫度由40 ℃ 冷卻到5 ℃,在5 ℃下保持2 min,然后由5 ℃加熱到40 ℃,測(cè)定儲(chǔ)能模量(G′)和損耗模量(G″)隨溫度掃描的變化,得到相角(δ)。
(3)明膠模量分析
采用DHR-1流變儀測(cè)定樣品的凝膠性。DHR-1流變儀測(cè)定6.67%的經(jīng)超聲處理的明膠樣品的黏彈性,設(shè)定溫度變化速率為1 ℃/min,控制應(yīng)力3.0 Pa,測(cè)試夾具40 mmA1平板,Peltier溫度控制系統(tǒng),板間距為0.15 mm,明膠樣品溶化后于流變儀上溫度由40 ℃冷卻到5 ℃,在5 ℃下保持2 min,然后由5 ℃加熱到40 ℃,測(cè)定儲(chǔ)能模量(G′)和損耗模量(G″)。隨溫度掃描的變化測(cè)定時(shí)間為37 min。
1.3.5 紅外光譜分析
稱(chēng)取經(jīng)不同超聲處理的干明膠1 mg分別與1 g溴化鉀(KBr)研磨均勻后,置于40 ℃下烘干一夜,取出壓片。用Spectrun100紅外光譜儀檢測(cè)紅外吸收,掃描范圍400~4 000 cm-1,掃描次數(shù)32次,分辨率4 cm-1。 曲線(xiàn)擬合采用Origin 8.0,酰胺A帶、酰胺Ⅰ帶峰位置以及AⅢ/A1453的變化采用Perkin Elmer進(jìn)行分析。
1.3.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析
每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,并計(jì)算出平均值以及標(biāo)準(zhǔn)方差來(lái)表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用軟件Origin 8.0進(jìn)行作圖,用軟件SPSS 20.0進(jìn)行顯著性差異分析(P<0.05 及P<0.01)。
不同超聲條件處理后明膠凝膠強(qiáng)度變化趨勢(shì)如圖1所示,在不同超聲功率下,明膠凝膠的凝膠強(qiáng)度均隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),功率為200、400、600 W的時(shí)候明膠凝膠強(qiáng)度均在10 min時(shí)達(dá)到最大值,分別達(dá)到393 g、446 g和415 g,相比于未經(jīng)過(guò)任何處理的明膠樣品,分別提高了76.27%、67.21%、72.28%。
圖1 超聲波對(duì)明膠凝膠強(qiáng)度的影響Fig.1 Effect of ultrasound on gelatin gel strength注:用t檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較。同一曲線(xiàn)中標(biāo)有不同大寫(xiě)字母、小寫(xiě)字母者分別表示組間差異極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)。
這說(shuō)明了適度超聲處理可以改善明膠凝膠特性。從超聲功率的角度分析,400 W處理后明膠凝膠強(qiáng)度最優(yōu),其次是600 W處理,最后是200 W 處理,其變化趨勢(shì)與超聲時(shí)間對(duì)明膠凝膠強(qiáng)度的影響一致,說(shuō)明適度超聲處理可以明顯改善明膠的凝膠強(qiáng)度,但超聲強(qiáng)度過(guò)大反而會(huì)導(dǎo)致明膠凝膠特性劣變。超聲波具有能量和波動(dòng)的雙重效應(yīng),一是空化效應(yīng),即在液體介質(zhì)中表現(xiàn)為泡的形成、破裂以及伴隨的能量的釋放;二是介質(zhì)和容器也可以通過(guò)聲的吸收產(chǎn)生共振性質(zhì)的二級(jí)效應(yīng),如機(jī)械效應(yīng)等。這些效應(yīng)可以破壞維系明膠結(jié)構(gòu)的氫鍵平衡,甚至可以破壞肽鍵[11]。
適度超聲處理可以提高明膠的凝膠強(qiáng)度,可能是因?yàn)樵摋l件下空化效應(yīng)等作用并未斷裂明膠的肽鍵,保持了明膠亞基組分的完整性,但改變明膠的二級(jí)結(jié)構(gòu),使明膠亞基展開(kāi),在凝膠形成過(guò)程中更易形成類(lèi)三螺旋結(jié)構(gòu),進(jìn)而賦予明膠更好的凝膠特性。
應(yīng)用SDS-PAGE電泳檢測(cè)不同超聲處理后的明膠樣品的亞基組成及分子質(zhì)量分布,結(jié)果如圖2所示,圖中可以清楚看到明膠的α1鏈、α2鏈以及β鏈。
M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白; 1-200 W 1 min; 2-200 W 5 min; 3-200 W 10 min;4-200 W 20 min; 5-400 W 1 min; 6-400 W 5 min; 7-400 W 10 min; 8-400 W 20 min; 9-600 W 1 min; 10-600 W 5 min; 11-600 W 10 min;12-600 W 20 min; 13-未經(jīng)處理的明膠樣品圖2 超聲處理對(duì)明膠分子質(zhì)量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic treatment on gelatin molecular weight
由圖2可知,超聲處理使明膠組分產(chǎn)生了一定的降解,但從SDS-PAGE圖譜中小分子組分的顏色分析,大部分處理后降解程度的差異并不明顯,這可能與電泳的分辨率有關(guān)。對(duì)于超聲強(qiáng)度較大的600 W 20 min處理組,可明顯看到其小分子組分明顯高于其他處理組,說(shuō)明在較強(qiáng)超聲強(qiáng)度下,產(chǎn)生的空化效應(yīng)等會(huì)造成明膠亞基組分的降解,進(jìn)而導(dǎo)致明膠凝膠特性劣變。此外,因?yàn)殡娪镜那疤幚磉^(guò)程中破壞了明膠亞基間的非共價(jià)鍵,因此無(wú)法判斷超聲處理是否促進(jìn)了明膠亞基組分的聚集。因此擬通過(guò)流變學(xué)手段,進(jìn)一步研究超聲處理后明膠亞基組分變化情況。
流體在有相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)產(chǎn)生內(nèi)摩擦力以抗形變是流體的一種固有物理屬性,稱(chēng)為流體的黏性或黏滯性。不同超聲波預(yù)處理對(duì)明膠凝膠表觀黏度的影響如圖3所示。圖3表明在剪切速率為0~1 s-1,所有明膠樣品的黏度隨剪切速率的增加而降低,表現(xiàn)為剪切變稀,呈現(xiàn)假塑性流體的性質(zhì)[12]。黏度的降低主要是由于剪切過(guò)程中產(chǎn)生的物理作用力[13],在剪切過(guò)程中,液體介質(zhì)在剪切、振蕩等作用下,最終形成蛋白質(zhì)之間的布朗運(yùn)動(dòng)和氫鍵被破壞的綜合作用[14]。當(dāng)剪切速率增加以克服布朗運(yùn)動(dòng)和分子間碰撞時(shí),溶液在流動(dòng)區(qū)域內(nèi)變得更加有序,且對(duì)流動(dòng)的抵抗減弱,因此表現(xiàn)出較低的黏度[15-16]。
圖3 經(jīng)超聲波200 W、400 W、600 W處理對(duì)明膠凝膠表觀黏度的影響Fig.3 Effect of 200 W, 400 W, 600 W ultrasonic treatment on the apparent viscosity of gelatin gel
如圖3所示,經(jīng)超聲處理的明膠凝膠的黏度值基本高于空白值(即未經(jīng)過(guò)超聲處理的明膠),因此推測(cè)超聲處理過(guò)程產(chǎn)生的空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)等可能導(dǎo)致明膠亞基組分肽鏈展開(kāi),亞基氨基酸暴露,并通過(guò)氫鍵作用使亞基聚集體增加進(jìn)而造成其對(duì)流動(dòng)抵抗增強(qiáng)[17]。
總體來(lái)講,400 W處理后明膠的黏度值高于600 W 和200 W處理,證明黏度下降過(guò)程中400 W處理后的樣品中亞基組分間的互做更強(qiáng),凝膠特性更好,與凝膠強(qiáng)度結(jié)果一致。
相位角(tanσ)是耗能模量和儲(chǔ)能模量的比值稱(chēng)為損耗角正切(tanσ=G″/G′),表示黏彈性的度量,是蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)形成過(guò)程中的黏性和彈性的一個(gè)相對(duì)區(qū)分,即相位角越大,黏性越大,彈性越?。幌辔唤窃叫?,黏性越小,彈性越大[18]。因此,相位角的變化可以代表凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成的類(lèi)型,相位角越低,證明凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越好[16,19]。經(jīng)超聲不同功率處理后的明膠溶液tanσ值隨溫度的變化趨勢(shì)如圖4所示,隨著溫度的降低,明膠溶液的tanσ值先增加,而后突然出現(xiàn)拐點(diǎn),表明明膠出現(xiàn)了相變,隨后tanσ值隨著溫度的進(jìn)一步降低迅速下降,說(shuō)體系已經(jīng)由溶液變?yōu)槟z。
圖4 經(jīng)超聲波200 W、400 W、600 W處理后的明膠分別在冷卻過(guò)程中相角的變化Fig.4 The change of phase angle of gelatin treated by ultrasonic 200 W, 400 W and 600 W respectively during cooling
從明膠拐點(diǎn)的tanσ值看,空白組的tanσ值大于所有超聲處理組,說(shuō)明在本研究所選擇的超聲處理?xiàng)l件下,明膠凝膠特性均得到一定程度改善;而且3個(gè)超聲功率下,每個(gè)組明膠拐點(diǎn)的tanσ最低值均為10 min處理樣品,說(shuō)明其凝膠特性好于其他時(shí)間處理組,與凝膠強(qiáng)度結(jié)果一致。這主要是因?yàn)檫m度超聲所產(chǎn)生的空化效應(yīng)等改變了明膠的構(gòu)象,使之結(jié)構(gòu)適度展開(kāi),在后期凝膠形成過(guò)程中更有利于三螺旋結(jié)構(gòu)的形成。
儲(chǔ)能模量G′可以用以衡量凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)彈性形變過(guò)程中的能量?jī)?chǔ)存,代表凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的強(qiáng)度[8]。超聲波預(yù)處理對(duì)明膠凝膠儲(chǔ)能模量G′的影響如圖5所示。
a,b,c-冷卻;d,e,f-加熱圖5 超聲處理后的明膠在冷卻和加熱過(guò)程中儲(chǔ)能模量(G′)的變化Fig.5 Changes in storage modulus (G′) during cooling and heating of gelatin after sonication
由圖5可知,所有明膠樣品的G′都隨溫度的降低而升高,說(shuō)明隨著溫度越低,明膠凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)強(qiáng)度增大[20]。所有超聲處理的明膠凝膠樣品的儲(chǔ)能模量G′均高于未經(jīng)超聲處理的明膠樣品,再次證明本研究所選擇的超聲處理?xiàng)l件后,明膠凝膠特性均得到一定程度改善。從超聲功率的角度分析,400 W處理后樣品的G′最高,其次是600 W處理,200 W處理后明膠樣品的G′最低。說(shuō)明400 W處理后明膠中亞基組分構(gòu)象變化更適合于類(lèi)三螺旋結(jié)構(gòu)的形成,使明膠凝膠特性體系中網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)強(qiáng)度更大,進(jìn)而賦予了明膠更好的凝膠特性,與黏度結(jié)果分析一致。
超聲波作用后的明膠紅外光譜掃描圖如圖6所示。各組明膠的酰胺A帶、酰胺Ⅰ帶的峰位置以及酰胺Ⅲ帶與1 457 cm-1處的峰峰強(qiáng)度比值變化趨勢(shì)如表1所示。
圖6 超聲處理后明膠的紅外光譜掃描圖Fig.6 Infrared spectra of gelatin after ultrasonic treatment
表1 超聲處理明膠紅外光譜中酰胺A帶峰位置、酰胺Ⅰ帶峰位置、AⅢ/A1453的變化Table 1 Ultrasonic treatment gelatin infrared spectrum amide A peak position, amideⅠpeak position, AⅢ/A1453changes
在3 430~3 440 cm-1的吸收峰被認(rèn)為是酰胺A帶的譜帶,是N—H伸縮振動(dòng)的吸收峰,表明分子內(nèi)氫鍵的存在。當(dāng)N—H參與氫鍵的形成時(shí),酰胺A向低波數(shù)移動(dòng)。超聲處理過(guò)的明膠酰胺A帶均向低波數(shù)移動(dòng),說(shuō)明超聲處理后明膠中N—H參與的氫鍵均有所增加,這在明膠凝膠形成過(guò)程中更有利于類(lèi)三螺旋結(jié)構(gòu)的形成;這主要是因?yàn)槊髂z原有的氫鍵平衡在空化效應(yīng)等作用下發(fā)生改變,也是超聲處理后,明膠凝膠強(qiáng)度均有所增加的原因之一。不同超聲功率處理后,明膠中N—H參與形成的氫鍵變化差異不明顯,因此這不是造成不同超聲功率影響明膠凝膠特性差異的原因。
超聲過(guò)程中所產(chǎn)生的空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)可以改變蛋白的構(gòu)象,破壞蛋白原有空間結(jié)構(gòu),使蛋白展開(kāi)[17]。酰胺Ⅲ與1 453 cm-1峰強(qiáng)度之比(AⅢ/A1453),可以表征膠原三螺旋結(jié)構(gòu)完整度,比值越接近1表明膠原三螺旋結(jié)構(gòu)完整性越高[11]。由表1中數(shù)據(jù)可知,超聲處理均可造成明膠中三螺旋結(jié)構(gòu)的展開(kāi)。從超聲時(shí)間角度分析,隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng),AⅢ/A1453值呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),且超聲10 min處理,均造成明膠中三螺旋結(jié)構(gòu)展開(kāi)程度最大。明膠三螺旋結(jié)構(gòu)中亞基組分部分展開(kāi),可以使其在凝膠形成過(guò)程中有利于形成更多的類(lèi)三螺旋結(jié)構(gòu),賦予明膠更好的凝膠特性,這也是圖1中明膠凝膠強(qiáng)度最優(yōu)值均出現(xiàn)在10 min的原因。不同超聲功率下處理10 min時(shí),AⅢ/A1453值的趨勢(shì)與明膠凝膠強(qiáng)度并不一致,這可能是因?yàn)?,三螺旋結(jié)構(gòu)的展開(kāi)程度并不是影響明膠凝膠強(qiáng)度的唯一因素,當(dāng)明膠三螺旋結(jié)構(gòu)展開(kāi)超過(guò)一定程度后,其對(duì)明膠凝膠特性影響已經(jīng)不再明顯。
(1)經(jīng)過(guò)超聲波處理后的明膠樣品的凝膠強(qiáng)度明顯高于未處理的空白樣品,但凝膠強(qiáng)度隨著超聲時(shí)間的增強(qiáng)和功率的增大呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì),說(shuō)明適度超聲處理可以明顯改善明膠的凝膠強(qiáng)度,但超聲強(qiáng)度過(guò)大反而會(huì)導(dǎo)致明膠凝膠特性劣變。其中處理時(shí)間10 min與處理功率400 W的條件處理后的明膠凝膠強(qiáng)度最優(yōu)。
(2)電泳分析表明,在本實(shí)驗(yàn)所設(shè)置的超聲條件范圍內(nèi)對(duì)明膠進(jìn)行超聲處理,明膠亞基組分并未發(fā)生明顯降解。
(3)流變學(xué)分析表明,400 W超聲處理后明膠的黏度增加明顯,說(shuō)明在此條件下,超聲處理可能導(dǎo)致明膠亞基組分肽鏈展開(kāi),亞基氨基酸暴露,并通過(guò)氫鍵作用使亞基聚集體增加。明膠膠凝溫度與模量隨超聲條件變化趨勢(shì)與凝膠強(qiáng)度一致,說(shuō)明400 W處理10 min 后明膠中亞基組分構(gòu)象變化更適合于類(lèi)三螺旋結(jié)構(gòu)的形成。
(4)紅外光譜分析表明,超聲處理后明膠中N—H參與的氫鍵有所增加,同時(shí)會(huì)導(dǎo)致明膠三螺旋結(jié)構(gòu)中的亞基組分部分展開(kāi),可以使其在凝膠過(guò)程中有利于形成更多的類(lèi)三螺旋結(jié)構(gòu),賦予明膠更好的凝膠特性。