王 智，王 娟，包斯圖，翟羽佳

1北華大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 132001；2通遼市醫(yī)院，通遼 028000；3吉林市中心醫(yī)院，吉林 132001

膿毒癥是一種全身感染性疾病，可引起多臟器功能衰竭、休克，盡管在醫(yī)療技術(shù)發(fā)達(dá)的今天，膿毒癥28天死亡率仍高達(dá)32%[1]。膿毒癥心肌損傷是膿毒癥的主要合并癥，據(jù)統(tǒng)計(jì)膿毒癥患者40%～50%出現(xiàn)心肌抑制，7%發(fā)生心力衰竭[2]。LPS是G-菌細(xì)胞壁的主要成份，也是目前公認(rèn)的膿毒癥動(dòng)物及細(xì)胞模型的誘導(dǎo)劑[3]。大量研究證實(shí)[4,5]，LPS可導(dǎo)致炎性因子直接損傷心肌細(xì)胞并產(chǎn)生大量活性氧，損傷線粒體膜，影響ATP合成，激活細(xì)胞凋亡程序，進(jìn)而導(dǎo)致心功能障礙的發(fā)生。

黃芩苷是唇形植物黃芩的有效成分之一，其具有抗凋亡，抗腫瘤，抗炎，抗病毒，抗氧化，清除自由基，調(diào)節(jié)免疫等多種生物學(xué)作用[6,7]。赫連曼等[8]通過制備高血壓心肌病大鼠模型，證實(shí)黃芩苷可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引發(fā)的心肌細(xì)胞凋亡，從而逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)。另有學(xué)者證實(shí)[9,10]，黃芩苷對(duì)于衣霉素、羥自由基損傷的心肌細(xì)胞均有一定的保護(hù)作用。本團(tuán)隊(duì)在前期研究中證實(shí)，黃芩苷可通過抑制心室肌細(xì)胞β-AR/PKA/CaMKⅡ信號(hào)通路表達(dá)，從而起到減少心肌細(xì)胞凋亡，逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)的作用[11]。但黃芩苷對(duì)于酯多糖損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)作用尚未見報(bào)道，本研究擬通過培養(yǎng)人源AC16心肌細(xì)胞并制備酯多糖損傷模型，在細(xì)胞學(xué)水平模擬膿毒癥心肌損傷模型，觀察黃芩苷對(duì)酯多糖損傷心肌細(xì)胞線粒體的保護(hù)作用，為黃芩苷治療膿毒癥心肌損傷提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑與儀器

黃芩苷(江北藥業(yè)，批號(hào) 13659，純度≥98%；黃芪總黃酮(齊魯制藥有限公司)；二乙酸熒光素(美國Spectrum公司，貨號(hào)F1184)；AC16細(xì)胞購自廣州萊德爾公司；AnnexinV-FITC / PI凋亡檢測(cè)試劑盒(美國Invitrogen公司，貨號(hào)V13241)；；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)一抗、凋亡蛋白酶活化因子-1(Apaf-1)、(英國Abcam公司，貨號(hào)ab4825)； caspase-9，caspase-3一抗(中國博士德公司，貨號(hào)分別為BA0690，BM3957)；WD-9413B型凝膠成像系統(tǒng)(北京六一生物科技有限公司)；四唑鹽比色法(MTT)試劑盒(北京碧云天公司，貨號(hào)20170305) SD Cell 型轉(zhuǎn)移電泳槽(美國Bio-rad公司)；VE-180 型垂直板電泳裝置(北京原平皓生物科技有限公司)；FACSCanto Ⅱ型流式細(xì)胞儀(美國 BD公司)；SpectraMax M4型多功能酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

人源AC16心肌細(xì)胞于10%胎牛血清中，于5%濃度CO2條件下置于37 ℃恒溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后，檢測(cè)細(xì)胞活力，取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞隨機(jī)分為6組：對(duì)照組、LPS組(100 ng/mL LPS)、黃芩苷高劑量組(18 μmol/L+100 ng/mL LPS)、黃芩苷中劑量組(9 μmol/L +100 ng/mL LPS)、黃芩苷低劑量組(4.5 μmol/L +100 ng/mL LPS)[9]及黃芪總黃酮組(20 mg/L+100 ng/mL LPS)[12]，共同培養(yǎng)6 h。

1.3 細(xì)胞活力檢測(cè)

采用二乙酸熒光素染色檢測(cè)AC16心肌細(xì)胞活力。取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期AC16細(xì)胞置于6孔板中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁后棄掉培養(yǎng)液及未貼壁細(xì)胞。貼壁細(xì)胞分為6組，對(duì)照組正常培養(yǎng)，酯多糖(LPS)組細(xì)胞加入100 ng/mL LPS，黃芩苷組細(xì)胞在LPS組細(xì)胞基礎(chǔ)上分別加入18、9、4.5 μmol/L黃芩苷，黃芪總黃酮組在LPS組基礎(chǔ)上加入20 mg/L黃芪總黃酮，培養(yǎng)24 h后，用PBS緩沖液將二乙酸熒光素濃度調(diào)定在2.5 μg/L，20 ℃條件下避光孵育20 min，在顯微鏡下進(jìn)行觀察，確認(rèn)二乙酸熒光素積累活細(xì)胞內(nèi)(激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm)，并進(jìn)行拍照。

1.4 細(xì)胞存活率檢測(cè)

采用四唑鹽比色法(MTT)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞存活率，嚴(yán)格按照說明書操作；在酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度為450 nm條件下計(jì)算OD值，細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%。

1.5 心肌細(xì)胞三磷酸腺苷(ATP)含量檢測(cè)

每組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，吸除6孔板中培養(yǎng)液并加入200 μL裂解液。裂解后4 ℃條件下2 000 rpm，離心10 min取上清。將樣品加入96孔板后，加入100 μL ATP檢測(cè)工作液，震蕩混勻。使用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定相對(duì)光單位值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)值繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中ATP濃度。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率

制備單細(xì)胞懸液：各組心肌細(xì)胞胰酶消化20～25 min，加入小牛血清終止消化；沉淀重復(fù)上述步驟，如此反復(fù)實(shí)驗(yàn)幾次，用300目尼龍網(wǎng)過篩去掉較大團(tuán)塊；低速(500 rpm)離心5 min，棄上清。沉淀加入生理鹽水，離心5 min，棄上清；重復(fù)3次，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞的濃度為1×105個(gè)，加入AnnexinV-FITC 5 μL，充分混勻后再加入PI 5 μL混勻，常溫下避光反應(yīng)15 min，AnnexinV-FITC、PI熒光選取FSC作為閾值，排除樣品中的各種碎片及鞘液中的小顆粒，在CELQuest軟件獲取并分析數(shù)據(jù)，心肌細(xì)胞凋亡率=早期凋亡細(xì)胞%+晚期凋亡細(xì)胞%。

1.7 Western Blot檢測(cè)各組心肌細(xì)胞Cyt C、Apaf-1、caspase-9、caspase-3表達(dá)

提取各組心肌細(xì)胞蛋白，BCA法測(cè)定各組蛋白濃度，制備上樣液。取各組待測(cè)樣品20 μL和5 μL蛋白Marker，加入至SDS-PAGE電泳裝置中，進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜后脫脂牛奶封閉2 h，加入相應(yīng)一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入二抗anti-rabbit(1∶1 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，ECL顯像，暗室曝光，掃描膠片，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析。目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白的灰度值/內(nèi)參GAPDH的灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 二乙酸熒光素染色監(jiān)測(cè)AC16細(xì)胞活力

與對(duì)照組相比，LPS組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，細(xì)胞體積縮小，密度明顯降低；與LPS組相比，黃芩苷低、中、高劑量組與黃芪總黃酮組雖然心肌細(xì)胞體積出現(xiàn)不同程度的縮小，但心肌細(xì)胞密度明顯提高(見圖1)。

圖1 黃芩苷對(duì)LPS損傷AC16細(xì)胞二乙酸熒光素染色(×200)Fig.1 Baicalin staining of LPS-damaged AC16 cells with fluorescein diacetate (×200)注：A：對(duì)照組；B：LPS組；C：黃芩苷低劑量組；D：黃芩苷中劑量組；E：黃芩苷高劑量組；F：黃芪總黃酮組。Note:A:control group;B:LPS group;C:baicalin-L;D:baicalin-M;E:baicalin-H;F:total flavonoids of astraglus.

圖2 黃芩苷對(duì)LSP損傷AC16細(xì)胞存活率的影響Fig.2 Effect of baicalin on the survival rate of LSP-damaged AC16 注：對(duì)照組:Control;LPS組:LPS;黃芩苷低劑量組:Baicalin-L;黃芩苷中劑量組:Baicalin-M;黃芩苷高劑量組:Baicalin-H;黃芪總黃酮組:TFA;與對(duì)照組相比，*P<0.05，與LPS組相比，#P<0.05。Note:Control group：control；LPS group:LPS;baicalin low dose group:baicalin-L;baicalin medium dose group :baicalin-M;baicalin high dose group:baicalin-H;total flavonoids of astraglus group:TFA;compare with control group,*P<0.05;compare with LPS group，#P<0.05.

2.2 黃芩苷對(duì)AC16細(xì)胞存活率影響

與對(duì)照組相比，LPS組存活率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與LPS組相比，黃芩苷低、中、高及黃芪總黃酮組存活率均升高，且隨著劑量的升高而升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖2)。

2.3 各組AC16細(xì)胞三磷酸腺苷(ATP)含量

與對(duì)照組相比較，LPS組ATP含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與LPS組相比，黃芩苷低、中、高及黃芪總黃酮組ATP含量均升高，且隨著劑量的升高而升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖3)。

2.4 各組AC16細(xì)胞凋亡率檢測(cè)

流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示：對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為4.7%，LPS組細(xì)胞凋亡率為27.0%，黃芩苷低、中、高劑量組及黃芪總黃酮組細(xì)胞凋亡率分別為21.0%、14.5%、8.6%及12.5%。與對(duì)照組相比，LPS組心肌細(xì)胞凋亡率上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與LPS組相比，黃芩苷高、中、低劑量組及黃芪總黃酮組心肌細(xì)胞凋亡率下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖4)。

圖3 黃芩苷對(duì)LPS損傷AC16細(xì)胞ATP含量的影響Fig.3 Effect of baicalin on ATP content in AC16 cells injured by

2.5 各組AC16細(xì)胞中Cyt C、Apaf-1、caspase-9及caspase-3表達(dá)

與對(duì)照組相比，LPS組心肌細(xì)胞中Cyt C、Apaf-1、caspase-9及caspase-3表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與LPS組小鼠相比，黃芩苷高、中、低劑量組及黃芪總黃酮組心肌細(xì)胞Cyt C、Apaf-1、caspase-9、caspase-3表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖5，表1)。

3 討論

在膿毒癥急性期，對(duì)心肌細(xì)胞損傷以線粒體損傷為主，可導(dǎo)致患者心功能受損，影響患者預(yù)后。膿毒癥心肌損傷學(xué)說較多，有研究證實(shí)[13]，膿毒癥大鼠血清中一氧化氮、血管內(nèi)皮素-1等舒張血管因子表達(dá)均減少，說明膿毒癥可能通過破壞血管內(nèi)皮正常舒張功能，導(dǎo)致冠脈相對(duì)缺血引發(fā)心肌損傷。另外，線粒體損傷是目前研究膿毒癥心肌損傷的熱點(diǎn)之一，心臟搏動(dòng)晝夜不停，需要大量能量維持心肌細(xì)胞正常的生理作用，因此在人體中所有細(xì)胞中心肌細(xì)胞線粒體最為發(fā)達(dá)。已有研究表明[14-16]，膿毒癥可通過炎癥因子損傷、氧化應(yīng)激損傷、鈣超載及線粒體損傷等多重機(jī)制導(dǎo)致心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡。李登輝在基礎(chǔ)研究中發(fā)現(xiàn)[17]，膿毒癥大鼠在早期血清肌鈣蛋白(cTnI)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1(IL-1)即可出現(xiàn)升高，且炎癥因子與心肌損傷標(biāo)記物表達(dá)呈正相關(guān)，說明膿毒癥在早期可通過炎癥反應(yīng)損傷心肌細(xì)胞。本團(tuán)隊(duì)在既往的研究中發(fā)現(xiàn)，黃芩苷在多種心血管疾病中，均有抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用，其機(jī)制與阻斷β-AR/PKA/CaMKⅡ信號(hào)通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路有關(guān)[8,11]。王鵬等[18]通過觀察黃芩苷對(duì)缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞，證實(shí)黃芩苷對(duì)正常心肌細(xì)胞自噬無影響，但可顯著減少缺血再灌注心肌梗死面積，并降低再灌注后過度自噬的發(fā)生。本研究通過在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加LPS制備膿毒癥心肌損傷模型，并給予不同濃度黃芩苷進(jìn)行治療。研究發(fā)現(xiàn)，LPS損傷的AC16心肌細(xì)胞活力及細(xì)胞存活率下降，細(xì)胞凋亡增多，經(jīng)黃芩苷治療后心肌細(xì)胞活力及細(xì)胞存活率均升高，且細(xì)胞凋亡數(shù)量減少。說明LPS確實(shí)損傷心肌細(xì)胞，并導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，而黃芩苷對(duì)于LPS損傷心肌細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用。

圖4 黃芩苷對(duì)LPS損傷AC16細(xì)胞凋亡率的影響Fig.4 The effect of baicalin on the apoptosis rate of AC16 cells injured by LPS注：A：對(duì)照組；B：LPS組；C：黃芩苷低劑量組；D：黃芩苷中劑量組；E：黃芩苷高劑量組；F：黃芪總黃酮組。Note:A:control group;B:LPS group;C:baicalin-L;D:baicalin-M;E:baicalin-H;F:total flavonoids of astraglus.

圖5 黃芩苷對(duì)LPS損傷AC16細(xì)胞Cyt C、Apaf-1、caspase-9及caspase-3表達(dá)電泳圖Fig.5 Electrophoresis pattern of baicalin,Cypac C,Apasp-1,caspase-9 and caspase-3 in AC16 cells injured by baicalin 注：A：對(duì)照組；B：LPS組；C：黃芩苷低劑量組；D：黃芩苷中劑量組；E：黃芩苷高劑量組；F：黃芪總黃酮組。Note:A:control group;B:LPS group;C:baicalin-L;D:baicalin-M;E:baicalin-H;F:total flavonoids of astraglus.

組別GroupCyt C/GAPDHApaf-1/GAPDHcaspase-9/GAPDHcaspase-3/GAPDH對(duì)照組 Control0.62±0.080.43±0.050.13±0.010.35±0.06LPS組 LPS1.84±0.25?2.28±0.31?1.16±0.14?1.52±0.28?黃芩苷低劑量組 Baicalin-L1.47±0.19#1.26±0.2#1.02±0.11#0.68±0.08#黃芩苷中劑量組Baicalin-M0.84±0.16#1.10±0.08#0.57±0.04#0.62±0.05#黃芩苷高劑量組Baicalin-H0.56±0.09#0.83±0.07#0.42±0.04#0.36±0.04#黃芪總黃酮組Total flavonoids of astraglus0.79±0.06#0.82±0.09#0.61±0.05#0.86±0.13#

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05，與LPS組相比，#P<0.05。

Note:Compare with control,*P<0.05;compare with LPS group，#P<0.05.

在本研究中發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可有效增加LPS損傷AC16細(xì)胞中ATP的含量，保證細(xì)胞能量供給，這可能是黃芩苷增加細(xì)胞活性，減少心肌細(xì)胞凋亡的重要因素之一。細(xì)胞凋亡可能不是細(xì)胞唯一的死亡方式，但卻是目前在結(jié)構(gòu)、生化及基因水平已知蛋白質(zhì)構(gòu)成的死亡通路唯一形式。Cyt C/ Apaf-1/caspase-9/caspase-3信號(hào)通路，是心肌細(xì)胞線粒體凋亡的主要信號(hào)通路之一。當(dāng)線粒體損傷發(fā)生后，釋放到胞質(zhì)中的Cyt C與多聚化的Apaf-1結(jié)合，再與輔因子ATP結(jié)合，形成復(fù)合體，在此過程中促凋亡因子Bax與抑制凋亡因子Bcl-2亦參與了Cyt C與Apaf-1的結(jié)合，共同激活caspase-9形成凋亡體，開啟瀑布效應(yīng)激活caspase-3的因子，觸發(fā)凋亡反應(yīng)[19-20]。本研究證實(shí)，黃芩苷可有效抑制AC16心肌細(xì)胞中Cyt C/ Apaf-1/caspase-9/caspase-3信號(hào)通路的表達(dá)，并且劑量越高，細(xì)胞中表達(dá)越低。與之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果共同分析，推測(cè)黃芩苷可能通過阻斷Cyt C/ Apaf-1/caspase-9/caspase-3信號(hào)通路的激活，并增強(qiáng)心肌細(xì)胞中ATP的含量，減少心肌細(xì)胞凋亡， AC16細(xì)胞受到LPS損傷得以緩解，進(jìn)而增強(qiáng)心肌細(xì)胞活力及生存率。但其作用靶點(diǎn)是從內(nèi)源性凋亡信號(hào)通路上游即開始發(fā)揮抑制作用，亦或?qū)yt C/ Apaf-1/caspase-9/caspase-3信號(hào)通路的中間蛋白及相關(guān)催化酶均有抑制作用，需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)加以佐證。

綜上所述，黃芩苷可抑制LPS損傷心肌細(xì)胞中Cyt C/ Apaf-1/caspase-9/caspase-3信號(hào)通路的表達(dá)，減少心肌細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)線粒體內(nèi)ATP的合成，從而起到提高心肌細(xì)胞活性及生存率的作用，并為黃芩苷在膿毒癥心肌損傷的臨床實(shí)踐治療中提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。