鄺洪軒, 張海彬, 譚建華, 雒亦凡, 劉舒華, 龐啟華,2, 李楚華, 范瑞芳*

(1. 華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 廣東省藥食資源生物加工及綜合利用工程技術(shù)研究中心, 廣東 廣州 510631; 2. 廣東工業(yè)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程系, 廣州市環(huán)境催化與污染控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州 510006; 3. 廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院, 廣東 廣州 511447)

神經(jīng)遞質(zhì)(neurotransmitters)是一類由神經(jīng)元合成并釋放,通過(guò)突觸傳遞完成神經(jīng)元之間信號(hào)傳遞的化學(xué)物質(zhì)。基于物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì),神經(jīng)遞質(zhì)可分為氨基酸類(如谷氨酸(glutamic acid, Glu)、γ-氨基丁酸(γ-amino butyric acid, GABA))、生物胺類(如5-羥色胺(serotonin, 5-HT)、多巴胺(dopamine, DA))以及膽堿類(如乙酰膽堿(acetylcholine, Ach))。機(jī)體中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì)參與多種生理活動(dòng),包括睡眠、學(xué)習(xí)、記憶、情緒反應(yīng)、精神活動(dòng)等。個(gè)體大腦中樞神經(jīng)遞質(zhì)的變化直接影響生物體的行為和活動(dòng),進(jìn)而誘導(dǎo)精神病學(xué)和神經(jīng)病學(xué)疾病的發(fā)生[1]。因此簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、快速檢測(cè)生物體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的含量,對(duì)于準(zhǔn)確解釋神經(jīng)生理活動(dòng)機(jī)制具有重要的意義。

部分神經(jīng)遞質(zhì)光敏感性強(qiáng)、極易被氧化(如多巴胺),且在生物樣品中的含量很低,樣品基質(zhì)復(fù)雜[2],因此如何避免神經(jīng)遞質(zhì)被氧化的樣品前處理方法和高靈敏度的檢測(cè)手段是神經(jīng)遞質(zhì)含量測(cè)定研究的重點(diǎn)。高效液相色譜(HPLC)分離后用紫外(ultra violet)[3]、熒光(fluorescence)[4-6]、電化學(xué)(electrochemical detection)[7-9]和質(zhì)譜(mass spectrometry)[1,2,10,11]方法檢測(cè),是目前神經(jīng)遞質(zhì)測(cè)定較常用的方法。但前3種檢測(cè)方法一般需要對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)行衍生化處理,不僅衍生步驟繁瑣,耗時(shí)耗力,而且存在有機(jī)體內(nèi)源性類似物的干擾,生成非目標(biāo)衍生物,衍生程度也難以保證。而超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法兼具分離能力和靈敏度高、特異性好等優(yōu)勢(shì),已逐漸成為生物樣品中痕量生物活性物質(zhì)分析的強(qiáng)有力手段[12-14]。

本研究建立了同位素稀釋-UPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定大鼠海馬體5種神經(jīng)遞質(zhì)(Glu、GABA、Ach、DA和5-HT)的快速分析方法。該方法重現(xiàn)性好,靈敏度高,無(wú)需進(jìn)行衍生化處理,且維生素C(vitamin C, VC)的加入有效地解決了DA和5-HT前處理和儲(chǔ)存過(guò)程中的氧化問(wèn)題,并成功應(yīng)用于新生期雙酚A(bisphenol A, BPA)暴露后大鼠海馬體5種神經(jīng)遞質(zhì)含量的定量分析,為以動(dòng)物和細(xì)胞為對(duì)象的毒理研究提供了神經(jīng)遞質(zhì)的檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與化學(xué)試劑

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(UltiMateTM3 000標(biāo)準(zhǔn)四元系統(tǒng)液相色譜,TSQ Quantiva三重四極桿質(zhì)譜儀,Thermo Fisher Scientific公司,美國(guó));氮吹儀(DC-12,上海安譜科學(xué)儀器有限公司);低溫離心機(jī)(3K15, Sigma公司,美國(guó));超聲儀(SB-1000,寧波新藝超聲設(shè)備有限公司);分析天平(BSA224S,賽多利斯公司,德國(guó))。

標(biāo)準(zhǔn)品:5-羥色胺、5-羥色胺-D4、谷氨酸-D5、乙酰膽堿、乙酰膽堿-D9、γ-氨基丁酸和γ-氨基丁酸-D6購(gòu)自加拿大TRC公司;谷氨酸、多巴胺和維生素C購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;多巴胺-D4購(gòu)自加拿大CDN同位素公司;乙酰膽堿的純度為95%,其他標(biāo)準(zhǔn)品純度均大于98%。其他實(shí)驗(yàn)用的試劑包括甲醇、乙腈、甲酸和乙酸等均為色譜純,購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備

儲(chǔ)備液的配制:分別準(zhǔn)確稱量各神經(jīng)遞質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品,溶于2%(體積分?jǐn)?shù),下同)乙酸水-甲醇溶液(1∶1, v/v),配制成質(zhì)量濃度范圍為1～5 g/L的單標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確稱取100 mg VC標(biāo)準(zhǔn)品,溶于2%乙酸水溶液中,配制成10 g/L的儲(chǔ)備液,并充入足量氮?dú)?。所有?chǔ)備液放置于-20 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。分別移取定量單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至容量瓶中,加入2%乙酸水-甲醇溶液(9∶1, v/v)定容,制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液;然后依次用不同體積的2%乙酸水-甲醇(1∶1, v/v)溶液稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,配成6個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品混合液,用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 色譜與質(zhì)譜條件

色譜條件:選擇Ultimate AQ-C18(150 mm×4.6 mm, 3 μm,上海月旭公司)色譜柱作為分離柱;流動(dòng)相由A相(0.1%甲酸水)和B相(甲醇)組成;流速:0.4 mL/min;柱溫:28 ℃;進(jìn)樣量2 μL。梯度洗脫程序:0～1.00 min, 20%B; 1.00～2.00 min, 20%B～50%B; 2.00～2.50 min, 50%B～100%B; 2.50～6.00 min, 100%B; 6.01 min, 20%B; 6.01～10.00 min, 20%B。

表 1 質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass parameters

* Transitions used for quantification. CE: collision energy; RF: radio frequency; Ach: acetylcholine; 5-HT: serotonin; GABA:γ-amino butyric acid; DA: dopamine; VC: vitamin C.

質(zhì)譜條件:電噴霧離子(ESI)源,負(fù)離子模式;噴霧電壓:3 500 V;鞘氣流速:30 Arb;輔助氣流速:15 Arb;離子傳遞管溫度:325 ℃;霧化器溫度:350 ℃。優(yōu)化了各分析物的碰撞能量和透鏡電壓,并選擇合適的定量和定性離子對(duì),用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式進(jìn)行定量。具體參數(shù)見(jiàn)表1。

1.4 樣品前處理

哺乳期大鼠BPA暴露14天后,將其頸椎脫臼處死,取全腦。在冰浴中小心剝離出海馬體,準(zhǔn)確稱重后放入1.5 mL的塑料離心管中。加入250 μL 2%甲酸水和50 μL 10 g/L VC,勻漿2 min后繼續(xù)超聲提取15 min,然后在13 000 r/min的速度下離心40 min。取150 μL上清液至不含BPA的塑料離心管中。依次加入100 μL混合同位素內(nèi)標(biāo)和1 mL 2%甲酸乙腈溶液,充分渦旋振蕩,使蛋白質(zhì)沉淀。在13 000 r/min的速度下離心20 min,取625 μL上清液至干凈的玻璃試管中,氮?dú)獯蹈?。加? mL 2%乙酸水-甲醇(9∶1, v/v)溶液復(fù)溶,在12 000 r/min的速度下離心5 min,取700 μL上清液于2 mL液相自動(dòng)進(jìn)樣瓶中,充入氮?dú)?于-20 ℃冷凍保存待測(cè)。

1.5 質(zhì)控樣品

按照標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的配制方法,分別配制低、中和高水平的質(zhì)控樣品(Glu: 1 500、7 500和15 000 μg/L; GABA: 250、1 250和2 500 μg/L; Ach: 1.5、7.5和15 μg/L; 5-HT: 1、5和10 μg/L; DA: 1、5和10 μg/L)。此外,每一批次處理還包括兩個(gè)空白樣品,包括方法空白樣品(前處理方法同實(shí)際樣品,加入等量同位素內(nèi)標(biāo))和溶劑空白樣品(樣品處理方法同空白樣品,但是不加入同位素內(nèi)標(biāo))分別用以監(jiān)控處理過(guò)程中由于各種操作原因造成的污染和添加各種化學(xué)品引入的本底污染。所有標(biāo)準(zhǔn)曲線、質(zhì)控樣品的前處理方法與實(shí)際樣品等同。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

由于神經(jīng)遞質(zhì)化合物極性較強(qiáng),因此選擇了3種不同型號(hào)的、具備一定極性保留能力的反相液相色譜柱優(yōu)化分離目標(biāo)化合物,分別為ACQUITY UPLC HSS T3柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm, Waters公司,美國(guó))、Ultimate AQ-C18柱(150 mm×4.6 mm, 3 μm,上海月旭公司)和ACE C18-PFP柱(150 mm×4.6 mm, 3 μm, ACT公司,英國(guó))。由于Ach在ACQUITY UPLC HSS T3柱中峰形拖尾,而ACE C18-PFP柱對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)的保留較弱導(dǎo)致分離度不佳,最終選擇Ultimate AQ-C18柱作為分離柱。該色譜柱是以B型超高純?nèi)嗫浊蛐喂枘z為基質(zhì),碳載量高達(dá)12%,這使其不僅色譜峰形、分離效率、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性均極佳,且對(duì)親水性和極性化合物具有更強(qiáng)的保留能力和選擇性。

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),當(dāng)用于溶解樣品的溶液中甲醇比例較高時(shí),色譜分離中無(wú)論如何調(diào)整流動(dòng)相比例或更換其他型號(hào)的色譜柱,5-HT峰形分叉嚴(yán)重(見(jiàn)圖1)。而當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)低于10%時(shí),各類化合物均具有良好的峰形。因此,優(yōu)化了氮?dú)獯蹈珊髲?fù)溶目標(biāo)化合物的甲醇比例。考慮到5-HT具有一定的疏水性以及穩(wěn)定性,綜合考慮后選用2%乙酸水-甲醇溶液(9∶1, v/v)作為樣品溶解液而非2%乙酸水。

圖 1 溶解樣品溶液的甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)5-HT的色譜分離影響Fig. 1 Effects of the methanol volume percentages in re-dissolution solutions on the chromatogra-phic separation of 5-HT HAc: ethanoic acid; MeOH: methanol.

在梯度洗脫程序的優(yōu)化過(guò)程中發(fā)現(xiàn),Ach拖尾嚴(yán)重,這種現(xiàn)象均存在于上述3種色譜柱中,即使往流動(dòng)相中添加乙酸銨也不能明顯改善拖尾程度。多次調(diào)整流動(dòng)相比例后發(fā)現(xiàn),甲醇比例提高后,起始柱壓升高可以顯著改善Ach的拖尾現(xiàn)象。因此,梯度洗脫程序選擇了20%甲醇作為起始流動(dòng)相比例。部分神經(jīng)遞質(zhì)(如Glu)在腦中的含量很高(大于1 mg/g)[12],為了防止化合物的進(jìn)樣殘留對(duì)后一個(gè)樣本定量分析準(zhǔn)確性的影響,使用100%甲醇充分沖洗柱子達(dá)3.5 min。結(jié)果顯示,5種神經(jīng)遞質(zhì)的進(jìn)樣殘留率(carry-over)為1.4%～5.2%,符合歐洲藥品管理局(EMA)生物分析方法標(biāo)準(zhǔn)[15]的要求。

柱溫對(duì)各化合物的色譜響應(yīng)值雖無(wú)明顯影響,但對(duì)5-HT的色譜保留時(shí)間有顯著影響。5-HT的色譜保留時(shí)間隨柱溫的微小變化而變化,且溫度越高,保留時(shí)間越長(zhǎng)。由于部分神經(jīng)遞質(zhì)不穩(wěn)定,易于被氧化,所以色譜分離時(shí)間不宜太長(zhǎng)。在確保良好分離度的前提下,分析時(shí)間愈短愈好,最終確定28 ℃為分析柱溫。圖2為優(yōu)化色譜條件后的標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖和大鼠海馬體樣品色譜圖,單個(gè)樣品分析方法時(shí)間為10 min,其中目標(biāo)化合物3 min內(nèi)完全出峰。

2.2 靈敏度

連續(xù)測(cè)定6次連續(xù)稀釋的標(biāo)準(zhǔn)樣品,按照3倍信噪比(S/N)計(jì)算儀器檢出限(LOD), Glu、GABA、Ach、DA和5-HT的LODs分別為0.25、0.15、0.05、0.20和0.20 μg/L。將日內(nèi)精密度小于20%且其S/N大于10的最小標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度定義為定量限(LOQ),則Glu、GABA、Ach、DA和5-HT的定量限分別為1.0、0.50、0.15、0.60和0.60 μg/L(見(jiàn)表2)。

表 2 檢出限、定量限、線性范圍和相關(guān)系數(shù)Table 2 LODs, LOQs, linear ranges and correlation coefficients (R2)

圖 2 (a)5種神經(jīng)遞質(zhì)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和(b)海馬體樣品的色譜圖Fig. 2 Chromatograms of five neurotransmitters in (a) a mixed standard solution and (b) a rat hippocampus sample

2.3 穩(wěn)定性

圖 3 5種神經(jīng)遞質(zhì)色譜峰面積比值的穩(wěn)定性Fig. 3 Stabilities of the chromatographic peak area ratio for five neurotransmitters Snot VC: peak area of samples without VC; Sadd VC: peak area of samples with VC.

在標(biāo)準(zhǔn)品的連續(xù)進(jìn)樣中發(fā)現(xiàn),DA和5-HT的標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜峰響應(yīng)隨時(shí)間變化明顯。特別是DA,一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣后,其色譜響應(yīng)下降明顯,導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)曲線不呈線性。查閱資料[2,12]發(fā)現(xiàn),DA、5-HT都容易被氧化,從而不能與氧氣共存,所以在前處理過(guò)程中應(yīng)盡量避光,并簡(jiǎn)化前處理步驟、縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間。同位素內(nèi)標(biāo)的引入雖然在很大程度上解決了操作過(guò)程對(duì)定量結(jié)果產(chǎn)生的偏差問(wèn)題,但仍無(wú)法解決由于DA、5-HT在樣品處理和分析過(guò)程中的氧化而帶來(lái)的無(wú)法準(zhǔn)確定量問(wèn)題。因此,本研究嘗試往樣品中加入強(qiáng)還原性的VC以拮抗氧化劑對(duì)DA、5-HT的氧化。含有VC和不含VC的質(zhì)控樣品經(jīng)過(guò)前處理后,在室溫條件下保存,并于第1、2、3和10天測(cè)定5種神經(jīng)遞質(zhì)和VC的含量。結(jié)果顯示,Glu、GABA和Ach的峰面積比值(不加入VC的樣品響應(yīng)值/加入VC的樣品響應(yīng)值)較為穩(wěn)定,而DA和5-HT伴隨時(shí)間的增加其峰面積比值下降明顯。在第1天測(cè)定時(shí),5-HT和DA的峰面積比值分別為79.2%和18.8%,說(shuō)明在前處理過(guò)程中,不含VC的質(zhì)控樣品有約20% 5-HT和80% DA被氧化(見(jiàn)圖3)。當(dāng)缺乏VC時(shí),第1天DA峰高已極顯著降低,第2天已下降到檢出限附近,而加入VC后,DA在第10天依然可以檢測(cè)到明顯的色譜峰(見(jiàn)圖4)。與DA相比,5-HT在缺乏VC的情況下,在第10天雖能被檢測(cè)到,但其峰高亦顯著低于加入VC的樣品。因此在樣品前處理過(guò)程中,VC的加入可以扮演著“被優(yōu)先氧化”的角色,從而間接保護(hù)其他還原劑(DA和5-HT)不被氧化,增加了神經(jīng)遞質(zhì)前處理過(guò)程和儀器分析過(guò)程中樣品的穩(wěn)定性。因此在前處理以及標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過(guò)程中,應(yīng)當(dāng)加入足量(>0.5 g)的VC以抗氧化。

圖 4 維生素C對(duì)多巴胺和5-羥色胺色譜峰面積穩(wěn)定性的影響Fig. 4 Influence of VC on the determination stabilities of DA and 5-HT

2.4 方法精密度、加標(biāo)回收率和質(zhì)量控制

往稀釋5倍的大腦海馬體勻漿液中加入標(biāo)準(zhǔn)樣品,配制成4個(gè)不同水平加標(biāo)樣品,每個(gè)水平設(shè)6個(gè)平行樣,測(cè)定并計(jì)算日內(nèi)加標(biāo)回收率和精密度。連續(xù)6天重復(fù)配制并測(cè)定,計(jì)算日間加標(biāo)回收率和精密度。5種神經(jīng)遞質(zhì)的日內(nèi)加標(biāo)回收率為96.6%～118.0%,日間加標(biāo)回收率為92.9%～119%,日內(nèi)精密度(RSD)為0.39%～7.50%,日間精密度為1.33%～13.6%(見(jiàn)表3)。此外,由于實(shí)驗(yàn)用的玻璃器皿均經(jīng)過(guò)濃硫酸/重鉻酸鉀配成的洗液處理,且實(shí)驗(yàn)用試劑均為色譜純,因此在所有空白質(zhì)控樣品中均未檢出分析物。

2.5 實(shí)際應(yīng)用

新生期大鼠BPA暴露結(jié)束后,取不同性別的4個(gè)濃度組的大鼠海馬體,按照1.4節(jié)前處理方法提取神經(jīng)遞質(zhì)并進(jìn)行含量測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表4。與對(duì)照組相比,BPA暴露后,各個(gè)神經(jīng)遞質(zhì)的質(zhì)量濃度變化呈現(xiàn)出性別差異和劑量依賴性?？偟膩?lái)講,雄性和雌性大鼠5-HT、GABA的含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì),但Ach、Glu的含量卻呈現(xiàn)上升趨勢(shì),且DA的含量變化不大,這可能與不同的神經(jīng)遞質(zhì)負(fù)擔(dān)不同生理活動(dòng)有關(guān)。有意思的是,低濃度BPA暴露后,雄性大鼠海馬體5-HT含量顯著減少,Ach、Glu含量極顯著增加,而在雌性大鼠中僅引起了5-HT含量的顯著減少;中濃度BPA暴露后并未引起雄性大鼠海馬體5種神經(jīng)遞質(zhì)的顯著變化,而在雌性大鼠中卻引起了5-HT、GABA含量的顯著減少和Glu含量的顯著增加。因此,不同濃度BPA暴露對(duì)大鼠海馬體神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響表現(xiàn)出性別差異性,這和其他文獻(xiàn)報(bào)道[16]的結(jié)論相一致。

表 3 日內(nèi)和日間加標(biāo)回收率和精密度(n=6)Table 3 Intra- and inter-day spiked recoveries and precisions (n=6)

表 4 雙酚A暴露后大鼠海馬體中5種神經(jīng)遞質(zhì)的含量Table 4 Five neurotransmitter levels in hippocampus of the rats exposed to bisphenol A

Mann-Whitney U test, *p<0.05; **p<0.01.

3 結(jié)論

建立了同位素內(nèi)標(biāo)稀釋-UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定大鼠海馬體5種神經(jīng)遞質(zhì)(Glu、GABA、Ach、DA、5-HT)的方法。該方法操作快捷、高效,無(wú)需衍生化處理,且檢出限低,線性度、方法精密度和精確度良好,能在3 min內(nèi)完成5種神經(jīng)遞質(zhì)的同時(shí)分析。該方法已被成功應(yīng)用于新生期BPA暴露后大鼠海馬體5種神經(jīng)遞質(zhì)含量的定量分析,為潛在的動(dòng)物在體毒理研究提供了技術(shù)支撐。