廖澤榮, 李永瑞, 古 樂(lè), 雷潤(rùn)宏, 苗云飛, 藍(lán)鴻穎, 鄧玉林, 耿利娜*

(1. 北京理工大學(xué), 北京 100081; 2. 北京京東方傳感技術(shù)有限公司, 北京 100176; 3. 北京大學(xué)第三醫(yī)院腫瘤放療科, 北京 100191)

細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)是脂質(zhì)雙分子層包繞形成的半球狀囊泡,由細(xì)胞釋放到細(xì)胞外環(huán)境,存在于血液、唾液、羊水、母乳和尿液等體液中。這些囊泡通常含有來(lái)自分泌細(xì)胞的細(xì)胞溶膠以及含量較高的細(xì)胞骨架蛋白和熱休克蛋白[1],表面覆蓋著整合素、糖蛋白和跨膜蛋白,這些蛋白質(zhì)參與了囊泡運(yùn)輸[2]。根據(jù)不同的形成機(jī)制和生理特征,EVs主要可以分為3大類(lèi),外泌體、微囊泡和凋亡小體。外泌體形成始于細(xì)胞內(nèi)吞凹陷,以一種向內(nèi)“萌芽”形成多泡內(nèi)含體,與細(xì)胞膜融合后釋放其中的小囊泡;而微囊泡是母體向外“萌芽”脫落形成;凋亡小體是細(xì)胞程序性壞死或者凋亡晚期釋放的一種微囊泡。3種EVs不僅來(lái)源不同,大小也不同,外泌體的直徑在30～100 nm,微囊泡為100～1 000 nm,而凋亡小體大約500～4 000 nm[3]。但上面的分類(lèi)并不絕對(duì),據(jù)報(bào)道外泌體也可以達(dá)到250 nm的尺寸,一些被認(rèn)為是外泌體特有的標(biāo)志物同樣可以在非外泌體的囊泡上被發(fā)現(xiàn)[4]。EVs起初被認(rèn)為是細(xì)胞排出的廢物,但越來(lái)越多的研究表明,EVs存在重要的生物學(xué)功能,不僅參與細(xì)胞間的物質(zhì)和信息傳遞,而且在細(xì)胞遷移、血管新生、免疫反應(yīng)以及腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等生理和病理過(guò)程中都發(fā)揮著重要作用[2,5-7]。故EVs的研究將有助于理解其生物學(xué)功能和作用機(jī)制,進(jìn)而推動(dòng)外泌體在癌癥防御[8]、 再生醫(yī)學(xué)[9]和藥物傳遞[10]等疾病治療以及癌癥等疾病診斷[11,12]中發(fā)揮重要作用。近些年,圍繞外泌體的EVs研究報(bào)道正在迅猛增長(zhǎng),基于外泌體的液體活檢產(chǎn)品已在美國(guó)銷(xiāo)售上市,比如分析血液中外泌體RNA檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌,ExoDx Lung(ALK)可以基于血漿外泌體準(zhǔn)確檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者的EML4-ALK突變,在體液活檢中應(yīng)用的臨床轉(zhuǎn)化速度這一方面反映了對(duì)EVs的關(guān)注熱度。

表 1 根據(jù)篩分機(jī)理分類(lèi)Table 1 Classification by separation mechanism

然而,EVs的分離仍然是目前限制EVs相關(guān)研究和應(yīng)用的瓶頸問(wèn)題。由于體液特別是血樣的成分復(fù)雜,實(shí)現(xiàn)EVs高效快速分離仍然具有很大挑戰(zhàn),成為難點(diǎn)和熱點(diǎn)[13]。EVs分離的方法有超速離心、凝膠排阻層析、過(guò)濾、沉淀、免疫磁珠和微流控芯片等。其中基于尺寸、密度和表面電荷等物理特性進(jìn)行分離的超速離心、凝膠排阻層析、過(guò)濾等傳統(tǒng)方法存在通量低、繁瑣、沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)化方法、回收率低和純度低的問(wèn)題[14]。而采用沉淀分離方法和免疫磁珠[15-18]的商業(yè)化試劑盒存在容易發(fā)生非外泌體材料污染的問(wèn)題[3],且上述方法都更多地需要手工操作,通量和回收率低,容易造成外泌體變形和污染,因此不適合大多數(shù)科研和臨床應(yīng)用場(chǎng)合。

將EVs從復(fù)雜的生物環(huán)境中高效分離出來(lái),并保持EVs的結(jié)構(gòu)和組成完整,是任何涉及EVs及其相關(guān)過(guò)程(如疾病標(biāo)志物和藥物輸送)科學(xué)研究的關(guān)鍵步驟[3]。微流控芯片技術(shù)不僅具有微型化和自動(dòng)化的特點(diǎn),而且具有能夠?qū)崿F(xiàn)EVs的高效分離富集、下游EVs的操作處理、內(nèi)含物解析的整合以及可高通量并行操作等集成化特性,因此具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)。Chen等[19]首先將微流控芯片應(yīng)用于EVs的分離,近年來(lái)基于EVs分離[15,17,20,21]和分析[22-24]的微流控腫瘤體外診斷液體活檢技術(shù)受到較多關(guān)注。

本文對(duì)基于微流控芯片的EVs分離方法的研究進(jìn)展進(jìn)行了調(diào)研和總結(jié)。微流控芯片EVs分離方法可以從主動(dòng)和被動(dòng)的角度進(jìn)行分類(lèi),被動(dòng)方法包括基于抗體等的表面結(jié)合捕捉技術(shù)、基于多孔膜的篩分技術(shù)以及基于篩分結(jié)構(gòu)的捕集技術(shù),而主動(dòng)方法包括基于光學(xué)可極化特性的光鑷方法、超聲共振分離手段、介電電泳、電泳、流式分選以及磁分選[3]。如果從分離機(jī)制的角度,也可以將目前微流控芯片中EVs分離方法分為物理和生物兩大類(lèi)(見(jiàn)表1)。

1 物理分離技術(shù)

物理分離的機(jī)制主要是根據(jù)EVs的物理特性(如大小、變形性和流體力學(xué)特性等)的差異,通過(guò)在芯片中設(shè)置包括微孔、微過(guò)濾網(wǎng)[25,26]和微柱等不同的微結(jié)構(gòu)單元,以及利用慣性力和側(cè)向位移方法[20]、聲納米濾波系統(tǒng)[27]、電動(dòng)濃縮技術(shù)[28]和濃差極化電泳[29]分離EVs。物理技術(shù)提供了無(wú)須標(biāo)記或衍生化、僅憑芯片自身結(jié)構(gòu)或者其他物理手段實(shí)現(xiàn)外泌體分離的手段。國(guó)內(nèi)科學(xué)工作者開(kāi)展了卓有成效的工作,包括中科院納米中心課題組[30]利用微流控黏彈液流實(shí)現(xiàn)了外泌體的無(wú)場(chǎng)分離,清華大學(xué)課題組[31]采用介電泳方法分離外泌體,浙江大學(xué)課題組[25]采用雙層過(guò)濾技術(shù)實(shí)現(xiàn)微流控芯片外泌體的分離和富集。

1.1 篩分分離

目前,微流控芯片內(nèi)的篩分分離大體可以分為兩類(lèi):一類(lèi)是傳統(tǒng)的過(guò)濾分離,即在微流控芯片通道內(nèi)裝載過(guò)濾網(wǎng)[23]從而實(shí)現(xiàn)外泌體分離;第二類(lèi)是通過(guò)先進(jìn)的微機(jī)電加工技術(shù)(MEMS)在微流控芯片通道內(nèi)構(gòu)建不同的篩分結(jié)構(gòu),相較于傳統(tǒng)過(guò)濾分離,該方法依托各種的MEMS技術(shù),更加靈活可控。

利用H-filter結(jié)構(gòu),基于EVs的大小和擴(kuò)散系數(shù)差異進(jìn)行的場(chǎng)流分離方法也被用于EVs的分離[32],但是由于EVs的尺寸分布范圍廣,該方法的尺寸分離分辨率較低[33]。而通過(guò)Top-down的方式在芯片通道內(nèi)加工微柱陣列,利用EVs的尺寸和變形性不同,提高了EVs分離的選擇性。Wang等[34]將多孔硅納米線(xiàn)引入微柱陣列選擇性捕獲脂質(zhì)體,以排除蛋白質(zhì)分子等和更大顆粒物的影響,之后采用溶解納米線(xiàn)的方法釋放所捕獲的脂質(zhì)體。

1.2 確定性側(cè)向位移技術(shù)

同樣基于規(guī)則排列的納米柱,Santana等[35]建立的確定性側(cè)向位移方法(deterministic lateral displacement, DLD)是在微流體通道中根據(jù)被分離粒子的流體動(dòng)力學(xué)差異在柱間獲得不同的流動(dòng)軌跡,小于閾值的小顆粒會(huì)以zigzag軌跡在柱間移動(dòng),而在柱間反復(fù)碰撞的大顆粒會(huì)以位移軌跡模式移動(dòng),進(jìn)而實(shí)現(xiàn)分離。通過(guò)調(diào)整陣列的幾何參數(shù),或者整合使用多種規(guī)格陣列,該微流控策略可以控制不同大小顆粒的移動(dòng)軌跡。文獻(xiàn)[16]采用一種納米尺度下的DLD陣列技術(shù)實(shí)現(xiàn)了20 nm外泌體與膠質(zhì)物的分離。

1.3 聲波技術(shù)

聲波也可以用于EVs的分離,Lee等[36]利用聲納米濾波系統(tǒng)對(duì)EVs進(jìn)行了基于尺寸的分離。該方法通過(guò)將一對(duì)數(shù)字交叉換能器(IDT)電極作為超聲源,在通道內(nèi)產(chǎn)生駐波面聲波(SSAW),從而使大顆粒從中心線(xiàn)向通道壁附近的壓力節(jié)點(diǎn)偏移,而小顆粒停留在中心線(xiàn)上。通過(guò)調(diào)整聲場(chǎng)的頻率、振幅以及流速可以實(shí)現(xiàn)不同尺寸顆粒的分離,而通過(guò)組合使用不同的聲場(chǎng),并優(yōu)化排放位置可以進(jìn)一步改進(jìn)分離效果[22]。

1.4 流場(chǎng)-流分餾技術(shù)

Kang等[37]應(yīng)用流場(chǎng)-流分餾(FlFFF)技術(shù)分離包括外泌體在內(nèi)的亞細(xì)胞顆粒。所施加的外力為水動(dòng)力,樣品通過(guò)FlFFF在矩形微通道內(nèi)實(shí)現(xiàn)分離。細(xì)胞勻漿樣品組分由通道軸向遷移流攜帶至檢測(cè)器,因?yàn)閽佄镄瘟髦行牡牧魉俑哂诠鼙诟浇?因此較小的顆粒相對(duì)于較大的顆粒在與交叉流方向相反的方向上擴(kuò)散更快、移動(dòng)更遠(yuǎn),不同尺寸大小顆粒從而得以分離。

1.5 黏彈性微流控

最近Liu等[30]報(bào)道了另一種基于黏彈性微流控的無(wú)標(biāo)簽被動(dòng)EVs分離方法,顆粒分離取決于黏彈性介質(zhì)作用于不同粒徑顆粒產(chǎn)生彈性升力的差異。使用稀釋的聚(氧乙烯)(PEO)溶液作為黏彈性剪切流體,使EVs樣品沿通道側(cè)壁排列,優(yōu)化通道幾何形狀、PEO濃度和流動(dòng)條件對(duì)系統(tǒng)中的彈性升力進(jìn)行微調(diào),使大顆粒不斷向通道中心線(xiàn)遷移,從中間的出口收集大顆粒,而小顆粒(<200 nm)則從兩側(cè)出口流出。使用該裝置從未經(jīng)處理的胎牛血清(FBS)和細(xì)胞培養(yǎng)基中提取外泌體,純度和回收率分別達(dá)到90%和80%。

2 生物和化學(xué)分離技術(shù)

第二大類(lèi)方法是利用不同外泌體表面的生物和化學(xué)特性差異分離外泌體,主要基于抗原/抗體、受體/配體等生物特異性識(shí)別。將抗體、適配體固定于微通道內(nèi)的納米磁珠表面[15,38-40],或者將上述生物活性物質(zhì)固定在芯片通道內(nèi)微納結(jié)構(gòu)[41]、微納圖案表面[42],利用納米材料或者納米結(jié)構(gòu)的高比表面積增大生物親和組分與外泌體表面蛋白的接觸面積和接觸機(jī)會(huì)。基于免疫的分離方法具有常規(guī)理化方法所不具備的高選擇性?xún)?yōu)勢(shì),在臨床檢測(cè)和實(shí)驗(yàn)室研究中起到舉足輕重的作用,但是生物抗體始終存在較難獲得、價(jià)格昂貴、穩(wěn)定性差、與抗原結(jié)合后不易洗脫和無(wú)法重復(fù)使用缺點(diǎn),而且基于免疫等生物活性物質(zhì)的分離技術(shù)始終受制于對(duì)EVs表面特性的有限了解,同時(shí)還存在獲取相關(guān)蛋白質(zhì)難度大等問(wèn)題,因此影響了該方法的應(yīng)用和普及,需要價(jià)廉、穩(wěn)定和洗脫方便的抗體替代品引入微流控芯片。

3 綜合分離技術(shù)

除了不斷引入新的技術(shù)手段,也有報(bào)道組合使用已有的技術(shù),減少對(duì)某一技術(shù)的依賴(lài),克服單一技術(shù)的缺點(diǎn),不斷提升分離捕獲效率。比如利用在芯片上加工微納米篩分結(jié)構(gòu)與免疫方法結(jié)合分離外泌體[13,40,43]。武漢大學(xué)課題組[44]則是在芯片內(nèi)引入ZnO納米線(xiàn),利用基于納米線(xiàn)的微孔篩分和免疫方法結(jié)合實(shí)現(xiàn)外泌體的分離。

在各種生物分離技術(shù)中,分子印跡技術(shù)模擬了抗原和抗體作用,是一種人工合成具有分子識(shí)別功能的新型高分子材料的技術(shù)。分子印跡可以針對(duì)不同模板“一對(duì)一”定制獲得選擇性和立體識(shí)別性,因其更加可靠耐用、易于化學(xué)合成,與生物抗體相比有很多優(yōu)勢(shì)而受到研究者們的青睞[45,46]。本課題組已將天然生物親和元件-適配體與分子印跡技術(shù)相結(jié)合制備出具有更高生物親和性和選擇性的外泌體印跡材料。在此基礎(chǔ)上,我們又將該材料引入微流控芯片構(gòu)建外泌體捕獲新方法[47]。

4 結(jié)論

細(xì)胞外囊泡是存在于體液中的小顆粒,內(nèi)含復(fù)雜的蛋白質(zhì)和核酸等成分,利用細(xì)胞外囊泡實(shí)現(xiàn)臨床診斷、作為疾病治療手段或者了解細(xì)胞內(nèi)通訊已引起科學(xué)界越來(lái)越大的興趣。但到目前為止,EVs的定義和表征尚不明確,缺乏標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)議。有研究表明,EVs中的蛋白質(zhì)成分會(huì)隨著樣品放置時(shí)間而發(fā)生幾乎會(huì)被忽略的變化,說(shuō)明樣品分離和前處理方法的建立和標(biāo)準(zhǔn)化的重要和迫切性。微流控芯片具有微型化、自動(dòng)化和集成化等優(yōu)勢(shì),將分離以及各種分析技術(shù)引入微流控芯片,能夠?yàn)榧?xì)胞外囊泡捕獲和解析提供一個(gè)高通量、高開(kāi)放性和高穩(wěn)定性的樣本到結(jié)果(sample-to-result)平臺(tái),有望為基于細(xì)胞外囊泡的醫(yī)學(xué)研究以及體液活檢技術(shù)開(kāi)辟一條新的道路。