劉俊，寧蘭蘭，趙子文，馬為，王漢平，徐邦牢

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市第一人民醫(yī)院，廣州510180)

肺癌是一種常見惡性腫瘤，在我國呈現(xiàn)出高發(fā)病率和高致死率的流行病學(xué)和臨床特征，嚴(yán)重威脅了我國居民的健康并造成嚴(yán)重的社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占肺癌的80%～85%，患者預(yù)后較差[1]。近年來，以表皮生長因子受體(EGFR)為靶點(diǎn)的分子靶向治療在晚期NSCLC治療中取得了重大進(jìn)展，然而患者易出現(xiàn)耐藥。進(jìn)一步研究表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)發(fā)生耐藥的機(jī)制十分重要。吉非替尼是一種選擇性EGFR-TKIs，可阻礙腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和血管生成，并增加腫瘤細(xì)胞的凋亡[2]。國內(nèi)外有關(guān)研究[2～8]顯示，在吉非替尼耐藥的NSCLC細(xì)胞中胰島素樣生長因子1受體(IGF-1R)信號通路被激活，提示IGF-1R可能影響NSCLC細(xì)胞對吉非替尼的耐藥性。2016年1月～2017年7月，本研究擬通過構(gòu)建下調(diào)IGF-1R表達(dá)的人肺腺癌A549細(xì)胞株，觀察其對吉非替尼耐藥性的影響，為預(yù)測患者對EGFR-TKIs產(chǎn)生耐藥提供可能性的檢測指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 人肺腺癌細(xì)胞株A549購自美國ATCC公司。siRNA構(gòu)建試劑盒(廣州輝駿生物科技有限公司)；RNA iso Plus試劑盒(日本TaKaRa公司)；real-time PCR相關(guān)試劑盒(上海基爾頓生物科技有限公司)；相關(guān)Western blotting一抗及二抗(美國Cell Signaling Technology公司)；CCK-8試劑盒(上海前塵生物科技有限公司)。

1.2 建立吉非替尼耐藥細(xì)胞株A549/GR 以人肺腺癌細(xì)胞株A549為親本細(xì)胞，體外采用低濃度逐步加量誘導(dǎo)法建立吉非替尼耐藥細(xì)胞株A549/GR(陽性對照組)。即在親本細(xì)胞中，每天逐漸增加吉非替尼濃度培養(yǎng)，第1天0.5 μmol/L、第2天1 μmol/L、第3天1.5 μmol/L、第4天2 μmol/L，連續(xù)培養(yǎng)4 d，后續(xù)一直用2 μmol/L吉非替尼培養(yǎng)，直至加入吉非替尼后，細(xì)胞不再出現(xiàn)死亡時(shí)表示成功建立了吉非替尼耐藥細(xì)胞株A549/GR。將其用于吉非替尼處理后的細(xì)胞活力的陽性對照。

1.3 構(gòu)建靶向IGF-1R的siRNA 選擇3條siRNA序列和1條隨機(jī)對照序列。慢病毒載體構(gòu)建siRNA，分別設(shè)計(jì)4對引物(IGF-1R-siRNA1、IGF-1R-siRNA2、IGF-1R-siRNA3、NC-siRNA)并進(jìn)行體外構(gòu)建。取4只Wistar大鼠，于大鼠尾靜脈處使用微量注射器取分別注射6 μL含有上述四種siRNA的病毒稀釋液[9]。72 h后，分離4只大鼠腸道組織，利用RNA iso Plus試劑盒提取腸道組織中總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，隨后利用real-time PCR檢測上述分離的腸道組織中細(xì)胞內(nèi)IGF-1R mRNA的表達(dá)。感染3條特異性針對IGF-1R的siRNA(IGF-1R-siRNA1、IGF-1R-siRNA2、IGF-1R-siRNA3)與感染陰性對照序列NC-siRNA比較，其腸道組織中IGF-1R mRNA相對表達(dá)量分別為(73.2±4.8)%、(32.1±2.7)%、(56.5±3.6)%，IGF-1R-siRNA2的IGF-1R mRNA相對表達(dá)量最低，選擇進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，同時(shí)將其命名為IGF-1R-siRNA。

1.4 IGF-1R siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞 取6孔培養(yǎng)板，接種2 mL細(xì)胞密度為4×104個(gè)/mL的A549細(xì)胞，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2狀態(tài)孵育箱培養(yǎng)24 h。當(dāng)細(xì)胞生長融合達(dá)90%時(shí)，按照轉(zhuǎn)染細(xì)胞試劑盒說明書操作。將選中的IGF-1R-siRNA和NC-siRNA分別與轉(zhuǎn)染試劑混合，上下吹打5遍，室溫下放置15 min以形成轉(zhuǎn)染復(fù)合體后從培養(yǎng)板中小心吸出生長培養(yǎng)基，再加入300 μL含10%胎牛血清生長培養(yǎng)基，隨后分別加入至細(xì)胞中，輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)板使轉(zhuǎn)染復(fù)合體均勻分布，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。得到轉(zhuǎn)染IGF-1R siRNA細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)組)及NC-siRNA細(xì)胞(陰性對照組)。

1.5 IGF-1R mRNA表達(dá)檢測 采用real-time PCR法。用RNA iso Plus試劑盒提取1.4實(shí)驗(yàn)組、陰性對照組細(xì)胞樣品，根據(jù)試劑盒說明書提取和純化總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)的cDNA，作為PCR反應(yīng)的模板。其中用于檢測IGF-1R表達(dá)的PCR上游引物為5′-TGCCCCACTCTACTTCCCTG-3′，下游引物為5′-GGCGGTCTTAGCCTCTTCTGT-3′。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)。用β-actin作為內(nèi)參基因，并采用2-ΔΔCt法分析IGF-1R mRNA的相對表達(dá)量。

1.6 IGF-1R蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。取1.4實(shí)驗(yàn)組、陰性對照組細(xì)胞，加入蛋白裂解液(其中RIPA∶PMSF=99∶1)，置于冰上充分勻漿，離心后取上清。用BSA法進(jìn)行蛋白定量，上樣量約為40 μg/μL，電泳1 h后，濕轉(zhuǎn)法2 h，5%脫脂牛奶封閉，一抗(1∶1 000)孵育過夜(4 ℃)，TBST清洗3～5遍后，加入二抗(兔抗鼠，1∶10 000，4 h)。經(jīng)TBS-T洗脫后，將PVDF膜置于吸水紙上吸干水分，均勻孵育化學(xué)發(fā)光液，進(jìn)行顯影操作。根據(jù)顯影情況適當(dāng)調(diào)整曝光時(shí)間，用Gene Snap進(jìn)行圖像拍攝，隨后可使用Photoshop軟件對蛋白采取半定量分析。目的蛋白的相對表達(dá)量為目的蛋白積分光密度/β-actin積分光密度。

1.7 細(xì)胞活力測算 采用CCK-8比色法。取實(shí)驗(yàn)組、陰性對照組、陽性對照組細(xì)胞，且每組檢測4個(gè)時(shí)間點(diǎn)(0、12、24、48 h)的細(xì)胞活力，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔。取生長狀態(tài)良好的3組細(xì)胞，接種于96孔板，細(xì)胞密度為1×104個(gè)/孔。37 ℃、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞單層鋪滿孔底。此時(shí)，每孔加入終濃度為2 μmol/L吉非替尼進(jìn)行培養(yǎng)，記為0 h。隨后，再繼續(xù)培養(yǎng)的12、24、48 h。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)，每孔加入10 μL CCK-8，繼續(xù)孵育1 h后，用酶標(biāo)儀分別測定每孔細(xì)胞在450 nm處的光密度值。以陽性對照組細(xì)胞光密度值的平均值對應(yīng)的細(xì)胞活力為100%，將實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組各時(shí)間點(diǎn)每孔的光密度值與陽性對照組的光密度值平均值相比，計(jì)算得到各孔相對的細(xì)胞活力。

2結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞IGF-1R mRNA及蛋白表達(dá)比較 實(shí)驗(yàn)組、陰性對照組IGF-1R mRNA相對表達(dá)量分別為(31.7±2.5)%、(125.4±5.3)%，蛋白相對表達(dá)量分別為(27.4±3.5)%、(80.5±5.2)%，兩組比較P均<0.05。

2.2 兩組細(xì)胞活力比較 見表1。

表1 兩組細(xì)胞活力比較

注：與陰性對照組相比，*P<0.01。

3 討論

很多實(shí)體瘤組織中的EGFR表達(dá)增高，抑制EGFR活性成為治療一些實(shí)體瘤的策略[10～15]。臨床上使用的吉非替尼是一種EGFR特異性抑制劑，在治療局部晚期或轉(zhuǎn)移性NSCLC有明顯治療效果的同時(shí)，也使許多肺癌患者的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重耐藥[2,16,17]。有研究認(rèn)為，IGF-1R信號通路的活化與吉非替尼耐藥性的產(chǎn)生有關(guān)[5]。Patel等[17]則認(rèn)為吉非替尼對于EGFR蛋白家族T970M型突變較為敏感。上述研究結(jié)果提示，在一些實(shí)體瘤中，IGF-1R和EGFR的作用相似。本研究的理論基礎(chǔ)與幾篇研究[18,19]類似。本研究通過下調(diào)IGF-1R探究其對吉非替尼耐藥性的影響，確認(rèn)了IGF-1R是吉非替尼引起耐藥性的部分原因。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，下調(diào)IGF-1R的表達(dá)可顯著性增強(qiáng)人肺腺癌A549細(xì)胞對吉非替尼的敏感度，降低吉非替尼處理后的細(xì)胞活力。這提示，IGF-1R相關(guān)通路可能激活或增強(qiáng)EGFR的表達(dá)，而細(xì)胞加強(qiáng)對EGF等胞外生長因子的獲取，減弱吉非替尼的藥效，促進(jìn)腫瘤生長。下調(diào)IGF-1R可能相對應(yīng)減弱EGFR的表達(dá)，而細(xì)胞對胞外生長因子不敏感，增強(qiáng)對吉非替尼的敏感度。因此，后續(xù)可研究IGF-1R通路與EGFR之間的調(diào)控關(guān)系，更進(jìn)一步明確EGFR作為肺癌的治療靶點(diǎn)，也可增加IGF-1R作為肺癌治療的靶點(diǎn)。本研究為患者對EGFR-TKIs產(chǎn)生耐藥提供可能性的檢測指標(biāo)，對進(jìn)一步尋找IGF-1R高選擇性抑制劑具有重要的臨床意義和應(yīng)用前景。也可以在未來治療肺癌中聯(lián)合使用吉非替尼和IGF-1R抑制劑，或者在治療其他腫瘤中聯(lián)合使用EGFR-TKIs和IGF-1R抑制劑，期望可達(dá)到更好的治療效果。

IGF-1R和EGFR蛋白結(jié)構(gòu)類似，都是跨膜糖蛋白，具有酪氨酸激酶活性，可促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖[20]。這為設(shè)計(jì)特異性針對IGF-1R的抑制劑提供了很多重要的參考。除IGF-1R外，其他和EGFR及IGF-1R結(jié)構(gòu)類似的信號通路分子，也可能作為后續(xù)研究吉非替尼耐藥性的靶點(diǎn)。因?yàn)楹芏嗨幬锏脑O(shè)計(jì)是針對特定結(jié)構(gòu)域位點(diǎn)，但很多蛋白結(jié)構(gòu)類似，這樣也會有脫靶的出現(xiàn)。因此，藥物的特異性可能還需進(jìn)一步的優(yōu)化，以期待可解決藥物特異性和耐藥性的問題，更好地治療疾病。