蔡 輝 徐子涵 商 瑋 郭郡浩 趙智明 沈俊逸

(東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院(原南京軍區(qū)南京總醫(yī)院)中西醫(yī)結(jié)合科，南京 210002)

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是最常見(jiàn)的炎性關(guān)節(jié)病，可導(dǎo)致進(jìn)行性關(guān)節(jié)損傷和關(guān)節(jié)功能喪失，進(jìn)而造成殘疾[1]。已有研究表明，骨質(zhì)流失在RA疾病早期就開(kāi)始了，RA合并骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生率較一般人群明顯增加[2]。破骨細(xì)胞(Osteoclast，OC)是人體內(nèi)的主要骨吸收細(xì)胞，RA骨破壞主要是由于OC異?；罨瘜?dǎo)致的[3]。本研究通過(guò)分離RA患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，經(jīng)核因子κB受體活化因子配體(Receptor activator of nuclear factor-κB lig-and，RANKL)和巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)誘導(dǎo)培養(yǎng)為OC，觀察RA患者OC的分化情況，并分析該分化情況與RA骨破壞的關(guān)系，探究OC在RA骨破壞中的作用，以期為RA骨破壞的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1對(duì)象 選取2013年至2014年在東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科就診的符合2010年RA分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)[4]的活動(dòng)期RA患者12例，其中男2例，女10例，年齡(42.3±14.4)歲。健康志愿者10例為對(duì)照組，男7例，女3例，年齡(42.2±18.5)歲。兩組入選者均無(wú)長(zhǎng)期服用抗凝劑、性激素及影響骨代謝的藥物史，無(wú)糖尿病、甲狀腺、甲狀旁腺等內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，無(wú)嚴(yán)重肝腎功能損害。兩組患者均簽署知情同意書(shū)，并經(jīng)過(guò)東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2試劑 RANKL、M-CSF(Pepro Tech公司，美國(guó))、α-MEM培養(yǎng)基(Gibco公司，美國(guó))、胎牛血清(FBS)(杭州四季青，中國(guó))、人淋巴細(xì)胞分離液(Sigma公司，美國(guó))、抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)染色試劑盒(南京建成，中國(guó))、甲苯胺藍(lán)染液(上海碧云天，中國(guó))。

1.2方法

1.2.1建立外周血OC培養(yǎng)體系 分別采集RA組和對(duì)照組外周血8 ml，采用Ficoll密度梯度離心法分離獲得PBMC，用α-MEM完全培養(yǎng)液配制成PBMC細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106個(gè)/cm2接種于培養(yǎng)皿。培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)中孵育2 h，棄培養(yǎng)液，貼壁細(xì)胞為單核細(xì)胞，胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/cm2接種于空白24孔板和已預(yù)置骨磨片的24孔培養(yǎng)板中，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，用α-MEM完全培養(yǎng)液(含100 μg/L RANKL、50 μg/L M-CSF)培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，2～3 d換液1次。

1.2.2TRAP染色并計(jì)數(shù) 培養(yǎng)14 d后對(duì)接種于空白24孔板中的細(xì)胞進(jìn)行TRAP染色。按TRAP染液說(shuō)明書(shū)(南京建成)配制30 ml底物孵育液，37℃水浴10 min；用固定液將細(xì)胞固定5 min，水洗，加入底物孵育液37℃避光孵育60 min，水洗，用甲基綠復(fù)染 2～3 min，水洗。光鏡下觀察，胞漿呈深紅色為陽(yáng)性反應(yīng)。將TRAP染色陽(yáng)性且細(xì)胞核≥3個(gè)的多核巨細(xì)胞認(rèn)定為OC。每孔隨機(jī)取10個(gè)視野計(jì)數(shù)OC個(gè)數(shù)，重復(fù)計(jì)數(shù)3次，取均值。

1.2.3骨吸收功能檢測(cè) 培養(yǎng)21 d后取出骨磨片，將其分為A、B兩組，2.5%戊二醛將A組骨磨片固定10 min，乙醇脫水，加入1%甲苯胺藍(lán)染色10 min，水洗，光鏡下觀察骨吸收陷窩；B組骨磨片經(jīng)2.5 %戊二醛固定2 h，1%鋨酸固定2 h，乙醇逐級(jí)脫水，臨界點(diǎn)干燥，鍍金膜，掃描電鏡下觀察骨吸收陷窩。

1.2.4RA患者骨破壞的臨床評(píng)估 雙手X線Sharp評(píng)分：對(duì)RA患者進(jìn)行雙手X線攝片，由專(zhuān)業(yè)的放射科人員閱片，參照改良的Sharp評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[5]，對(duì)手和腕18個(gè)區(qū)域進(jìn)行關(guān)節(jié)間隙狹窄評(píng)分(0～4分)，對(duì)17個(gè)區(qū)域進(jìn)行骨侵蝕評(píng)分(0～5分)，計(jì)算關(guān)節(jié)間隙狹窄評(píng)分與骨侵蝕評(píng)分之和。

1.2.5骨密度(Bone mineral density，BMD)檢測(cè) 采用美國(guó)GE公司的Lunar Prodigy骨密度儀通過(guò)雙能X線吸收法(Dual energy X-ray absorptiometry，DXA)對(duì)RA患者腰椎L1-L4、全髖部、股骨頸進(jìn)行檢測(cè)，以T-score(T值)最低處表示BMD。

2 結(jié)果

2.1兩組OC生成數(shù)量的比較 經(jīng)TRAP染色后，顯微鏡下觀察，兩組均可見(jiàn)TRAP陽(yáng)性細(xì)胞的多核巨細(xì)胞，細(xì)胞體積大，呈類(lèi)圓形，胞漿著色加深，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)3～5個(gè)以上細(xì)胞核(見(jiàn)圖1)。RA組生成的OC數(shù)量較對(duì)照組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)，見(jiàn)圖2，表1。

2.2兩組骨吸收陷窩實(shí)驗(yàn)的比較 細(xì)胞與骨磨片共培養(yǎng)21 d，光鏡下可見(jiàn)A組骨磨片上出現(xiàn)深染的骨吸收陷窩，邊界清晰，呈類(lèi)圓形或不規(guī)則形。與對(duì)照組對(duì)比可見(jiàn)，RA組形成的骨吸收陷窩數(shù)量較多，面積較大(見(jiàn)圖3)。掃描電鏡觀察B組骨磨片，可見(jiàn)陷窩底部具有因骨膠原纖維殘留而顯粗糙的骨吸收特征，陷窩邊緣呈貝殼狀或不規(guī)則形。RA組形成的骨吸收陷窩面積較大，陷窩較深，呈穿鑿樣；而對(duì)照組形成的骨吸收陷窩面積小而淺(見(jiàn)圖4)。

圖1 光鏡下TRAP染色的觀察Fig.1 Observation of TRAP staining under an optical microscopeNote: A.×100；B.×200；C.×400.

圖2 兩組TRAP染色比較(×200)Fig.2 Comparison of TRAP staining in two groups(×200)Note: A.RA Group；B.Control Group.

表1 兩組OC生成數(shù)量比較(個(gè)/10個(gè)視野)Tab.1 Comparison of OCs numbers in two groups (/10 bins)

圖3 光鏡下骨吸收陷窩的觀察(×200)Fig.3 Observation of bone resorption lacunae under an optical microscope(×200)

2.3相關(guān)分析 對(duì)RA組患者進(jìn)行骨質(zhì)破壞的臨床評(píng)估(Sharp評(píng)分和BMD檢測(cè))，將RA組OC數(shù)量分別與Sharp評(píng)分和BMD(T值)進(jìn)行相關(guān)分析。RA組OC數(shù)量與Sharp評(píng)分呈顯著正相關(guān)(r=0.810，P=0.001)，與BMD(T值)呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.685，P=0.014)(見(jiàn)表2，圖5)。

圖4 掃描電鏡下骨吸收陷窩的觀察(×1 000)Fig.4 Observation of bone resorption lacunae under a scanning electron microscopy(×1 000)

表2 RA組OC數(shù)量與骨質(zhì)破壞臨床指標(biāo)的相關(guān)分析(n=12)Tab.2 Analysis of number of OCs and clinical indicators of bone destruction in RA group(n=12)

圖5 RA組OC數(shù)量與Sharp評(píng)分和BMD相關(guān)性分析散點(diǎn)圖Fig.5 A scatter diagram of correlation analysis between number of OCs and clinical indicators of bone destruction

3 討論

RA好發(fā)于40～50歲女性，在我國(guó)RA的臨床患病率為0.32%～0.38%[6]。RA會(huì)造成關(guān)節(jié)軟骨破壞和骨侵蝕，影響關(guān)節(jié)功能而降低患者生活質(zhì)量。高疾病活動(dòng)度、自身抗體陽(yáng)性和早期關(guān)節(jié)損傷，往往是不良預(yù)后的特征性因素[7]。

OC是主要的骨吸收細(xì)胞，來(lái)源于單核/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)。OC的異常增生與活化在RA骨破壞中發(fā)揮重要作用[8]。在膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)，滑膜組織及鄰近區(qū)域富集著大量RANK表達(dá)陽(yáng)性的破骨樣細(xì)胞(Osteoclast-like cell，OLC)，與局部骨侵蝕密切相關(guān)[9]。那么，與一般人群相比，RA患者體內(nèi)OC的分化情況是否有所不同呢？本研究將RA患者外周血單核細(xì)胞作為研究對(duì)象，通過(guò)外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)法建立OC培養(yǎng)體系，通過(guò)TRAP染色及骨吸收陷窩實(shí)驗(yàn)對(duì)OC進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示該方法能誘導(dǎo)培養(yǎng)出功能成熟的OC。觀察RA患者外周血OC的分化情況，與正常人群進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，兩組外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)生成的OC形態(tài)相似，RA患者外周血OC生成的數(shù)量明顯增加，骨吸收功能明顯增強(qiáng)，這與Durand等[10]的研究結(jié)果相一致，提示RA患者外周血OPC向OC的分化能力增強(qiáng)。在RA患者中，一方面炎性細(xì)胞因子直接或間接誘導(dǎo)OC分化并促進(jìn)其功能[11]；另一方面RA相關(guān)自體抗體不僅引起自身免疫復(fù)合物的形成而導(dǎo)致滑膜炎的發(fā)生，而且能與OPC結(jié)合直接促進(jìn)骨丟失[12]。

國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究多采用影像學(xué)分級(jí)對(duì)RA患者的手、腕關(guān)節(jié)局部骨質(zhì)破壞進(jìn)行評(píng)估，其中Van等[5]修訂的Sharp評(píng)分最為常用。BMD的測(cè)定可一定程度上反映RA患者全身骨丟失的情況。為進(jìn)一步探究RA患者OC分化能力增強(qiáng)與RA骨破壞的關(guān)系，本研究通過(guò)Sharp評(píng)分和BMD檢測(cè)評(píng)估RA患者骨破壞的情況，并與這些患者外周血誘導(dǎo)生成的OC數(shù)量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示RA外周血生成的OC數(shù)量與Sharp評(píng)分呈顯著正相關(guān)，與BMD(T值)呈顯著負(fù)相關(guān)，提示RA外周血生成OC的數(shù)量及功能與RA關(guān)節(jié)骨破壞和骨丟失的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。本研究尚存在不足之處，因?qū)嶒?yàn)時(shí)間及經(jīng)費(fèi)的局限性，采集的RA患者及健康志愿者的樣本量較少，后期應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步完善。

綜上所述，RA患者外周血OPC向OC的分化能力增強(qiáng)，且與RA關(guān)節(jié)骨破壞和骨丟失的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，然而其內(nèi)在機(jī)制尚未完全闡明，關(guān)于RA骨破壞機(jī)制的研究還需更深入的探索。