雷 茗 王春芳 黃華佗 譚 曇 黃艷云 韋葉生

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，百色 533000)

miRNA分子是一類(lèi)由內(nèi)源基因編碼的小RNA分子，由18～22個(gè)核苷酸序列組成，它的作用主要表現(xiàn)在靶基因mRNA的堿基與其3，-UTR末端互補(bǔ)配對(duì)，抑制或降解mRNA的表達(dá)從而起到基因調(diào)控的作用，約有1/3的基因受miRNA的調(diào)控[1-3]。miRNA-181a是miRNA-181基因家族里的重要成員，在多種疾病進(jìn)展中特異性表達(dá)，作用機(jī)制同miRNA分子一樣，主要是靶標(biāo)mRNA與 3，-UTR末端結(jié)合，從而抑制蛋白的表達(dá)起到基因調(diào)控的作用。近期的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA181a基因在心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，其主要機(jī)制是與靶基因GRP78(熱休克蛋白)、Bcl-2 mRNA結(jié)合，導(dǎo)致靶基因表達(dá)降低[4-6]。眾所周知，血脂異常是動(dòng)脈粥樣硬化、心梗、腦卒中等疾病的獨(dú)立誘發(fā)因素[7]，基因多態(tài)性與血脂相關(guān)性的研究也愈來(lái)愈多，Ye等[8]在對(duì)脂質(zhì)代謝相關(guān)miRNA結(jié)合位點(diǎn)多態(tài)性與代謝綜合征風(fēng)險(xiǎn)的研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP2基因rs5999924位點(diǎn)AA基因型攜帶者較其他基因型攜帶者的高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)高，在心腦血管疾病發(fā)病過(guò)程中起到保護(hù)性作用。Zhang等[9]在研究let-7基因家族rs10877887位點(diǎn)多態(tài)性與腦卒中發(fā)病關(guān)系中發(fā)現(xiàn)，rs10877887位點(diǎn)TT基因型攜帶者較TC、CC基因型攜帶者總膽固醇(TC)高，攜帶等位基因T的人群是腦卒中的易感人群。但miRNA181a基因多態(tài)性與血脂相關(guān)疾病的研究未見(jiàn)報(bào)道。本文探討298例廣西正常人群rs16927589位點(diǎn)基因多態(tài)性與HapMap公布的其他人群之間的差異，并深入研究rs16927589位點(diǎn)基因多態(tài)性與血脂水平的相關(guān)性，為廣西人群血脂水平相關(guān)的疾病研究和群體遺傳學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1資料 298例研究對(duì)象來(lái)源于2017年1月至2017年6月右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院健康體檢者，其中女性58例、男性240例、年齡區(qū)間18～80周歲，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室、影像學(xué)檢查，未見(jiàn)腫瘤、心腦血管疾病、血脂異常等，所選取研究對(duì)象之間無(wú)血緣關(guān)系，研究方案通過(guò)右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，研究對(duì)象都簽署了知情同意書(shū)。

1.2研究方法

1.2.1基因組DNA提取 空腹?fàn)顟B(tài)下抽取各受試對(duì)象4 ml靜脈血，選取EDTA-K2抗凝，全血DNA提取試劑盒(深圳亞能公司提供)提取DNA(操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行)。

1.2.2引物設(shè)計(jì)與合成 通過(guò)NCBI查找包含rs16927589位點(diǎn)的適宜長(zhǎng)度DNA片段，運(yùn)用Primer 3.0軟件，將查找到的DNA序列輸入并進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，得到的引物序列交由上海天昊科技有限公司合成。rs16927589位點(diǎn)上游引物序列為5′-TAATTAGGGGCAAGGGGAGGAT-3′，下游引物序列為5′-TATGTGGGGATATGTGGGCACT-3′，延伸引物序列為5′-TTTTTTTTTTTTTTTTTTCAAAGTGAAATGTGA-TAAGAACTGTC-3′。

1.2.3PCR及測(cè)序 PCR總反應(yīng)體系包括2 μl dNTPs，2 μl反應(yīng)緩沖液，1 μl DNA樣本，1 U TaqDNA聚合酶，上下游引物各1 μl，用高壓滅菌雙蒸水將體積補(bǔ)足至20 μl。啟動(dòng)PCR擴(kuò)增儀相應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增，采用2U的核酸外切酶Ⅰ(EXO Ⅰ，Epicentre)和5 U 蝦堿基磷酸酶(SAP，Promega)純化PCR產(chǎn)物，純化后使用SNaPshotMultiplex Kit(ABI)進(jìn)行延伸反應(yīng)，延伸完畢，加入1 U SAP 酶純化產(chǎn)物，采用ABI3730XL測(cè)序儀測(cè)序，將樣本DNA用DNA測(cè)序法再次進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，用Gene-Mapper 4.1(Applied Biosystems Co．Ltd．，USA)分析最終的原始測(cè)序數(shù)據(jù)。

1.2.4血脂檢查 空腹12 h，次日早晨靜息狀態(tài)下靜脈采血4 ml，離心分離血清，在日立7600生化儀上分別用相應(yīng)試劑檢測(cè)血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和極低密度脂蛋白膽固醇(VLDL-C)。

2 結(jié)果

2.1miRNA-181a 基因rs16927589位點(diǎn)基因型和等位基因 rs16927589位點(diǎn)基因型分布符合哈迪-溫伯格定律(Hardy-Weinberg)，說(shuō)明所選取受試對(duì)象具有群體代表性。測(cè)序結(jié)果顯示，rs16927589位點(diǎn)包含3種基因型，分別為T(mén)T、CT和CC，見(jiàn)圖1，其所占頻率分別為73.49%、25.50%和1.01%，等位基因T和C的頻率為86.24%和13.76%。

2.2廣西人群miRNA-181a基因rs16927589位點(diǎn)多態(tài)性在性別間的比較 經(jīng)檢驗(yàn)，miRNA-181a基因rs16927589位點(diǎn)基因型及基因頻率分布在廣西人群不同性別間比較，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.3廣西人群miRNA-181a基因rs16927589位點(diǎn)多態(tài)性與其他種族(地區(qū))人群之間比較 廣西人群rs16927589位點(diǎn)基因型與HapMap-YRI、HapMap-CEU比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，與Hap-Map-GIH、HapMap-JPT比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與HapMap-HGB比較，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

圖1 miRNA-181a基因rs16927589位點(diǎn)測(cè)序圖Fig.1 Sequencing map of miRNA-181a gene rs16927589 site

2.4廣西人群miRNA-181a基因rs16927589位點(diǎn)三種基因型攜帶者之間血脂水平比較 經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，rs16927589位點(diǎn)TT、CT和CC三種基因型攜帶者之間高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)和極低密度脂蛋白(VLDL-C)比較，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；CC組與TT、CT組膽固醇(TC)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CC組的膽固醇(TC)水平較TT、CT組低，TT組與CT組比較，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在三酰甘油(TG)比較中，TT組與CT組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TT組的三酰甘油(TG)較CT組低，CC組與TT、CT組分別比較，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表1 廣西人群miRNA-181a基因rs16927589位點(diǎn)基因型、等位基因頻率在不同性別間的比較Tab.1 Comparison of genotype and allele frequency of miRNA-181a gene rs16927589 locus in Guangxi population by sex

表2 廣西人群miRNA-181a基因rs16927589位點(diǎn)基因型與其他種族(地區(qū))人群之間的比較Tab.2 Comparison of genotype of miRNA-181a gene rs16927589 site in Guangxi people with other ethnic populations

表3 廣西人群miRNA-181a基因rs16927589位點(diǎn)三種基因型之間血脂水平比較Tab.3 Comparison of lipid indexes among genotypes of rs16927589 in miRNA-181a

3 討論

近年來(lái)，miRNA-181基因家族在多種疾病中的差異性表達(dá)陸續(xù)被報(bào)道，成為生物醫(yī)學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)。miRNA-181a 基因是miRNA-181基因家族里的重要成員，研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-181a 基因通過(guò)靶向調(diào)控炎癥因子參與了系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的發(fā)病過(guò)程[10]，而且在腦卒中的發(fā)展過(guò)程中也異常表達(dá)[11]，在惡性腫瘤的發(fā)生、侵襲、凋亡、轉(zhuǎn)移以及耐藥機(jī)制中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[12,13]。然而，由于地理位置、生活環(huán)境、風(fēng)俗習(xí)慣等的差異，基因多態(tài)性也會(huì)表現(xiàn)出差異性，既往研究發(fā)現(xiàn)，基因多態(tài)性的差異性往往與疾病的易感性密切相關(guān)。例如，相關(guān)研究對(duì)羅馬人和匈牙利人聽(tīng)力障礙相關(guān)NAT2、GRM7、GRHL2易感性基因多態(tài)性的研究中發(fā)現(xiàn)，NAT2、GRM7、GRHL2基因多態(tài)性表現(xiàn)出很顯著的種族間差異，這種種族間基因多態(tài)性的差異與聽(tīng)力障礙相關(guān)疾病的易感性相關(guān)，所以研究不同種族正常人群基因多態(tài)性的差異能為與之相關(guān)的疾病研究奠定理論基礎(chǔ)。

本研究發(fā)現(xiàn)，廣西人群miRNA-181a 基因rs16927589位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性在不同性別之間比較，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示在同一種族不同性別間，基因多態(tài)性不存在差異；將廣西人群進(jìn)一步與HapMap-YRI、HapMap-CEU、HapMap-GIH和HapMap-JPT比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其主要原因可能為廣西人群與HapMap-YRI、HapMap-CEU、HapMap-GIH和HapMap-JPT均不是同一種族，其遺傳背景、生活環(huán)境、風(fēng)俗習(xí)性、飲食習(xí)慣等均不相同[14-16]，而導(dǎo)致其基因多態(tài)性的差異。而將廣西人與HapMap-HGB之間比較發(fā)現(xiàn)，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其原因可能為廣西人與HapMap-HGB同屬于一個(gè)種族，親緣關(guān)系近。這也驗(yàn)證了Matyas 等[17]提出的不同種族間基因多態(tài)性存在差異的觀點(diǎn)。

大量研究表明，血脂異常與心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系[18-20]，血脂受到多基因位點(diǎn)的調(diào)控，這些基因在調(diào)控血脂過(guò)程中，由于種族，地理位置不同，基因發(fā)揮的作用大相徑庭，而同一位點(diǎn)突變的基因型與血脂的關(guān)系在不同種族人群間也存在差異[21]，因此，了解特定地區(qū)人群的血脂水平，探討與血脂水平相關(guān)的基因多態(tài)性，并對(duì)血脂水平加以控制，對(duì)該地區(qū)與血脂異常相關(guān)疾病的防治工作有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)，rs16927589位點(diǎn)CC基因型的膽固醇(TC)水平較TT、CT低， CT基因型的三酰甘油(TG)水平較TT基因型高，提示廣西人群中rs16927589位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與血清膽固醇(TC)水平和三酰甘油(TG)水平有關(guān)，在miRNA-181a 基因與血脂相關(guān)疾病的研究中，rs16927589位點(diǎn)具有研究?jī)r(jià)值。

綜上所述，本次研究不僅為進(jìn)一步疾病研究奠定了基礎(chǔ)，也為人類(lèi)群體遺傳學(xué)以及基因多態(tài)性的研究提供了數(shù)據(jù)。然而，本次研究也存在一定缺陷。一方面，本次納入的研究人群男性多于女性，可能會(huì)對(duì)基因型與血脂水平的相關(guān)性分析產(chǎn)生一定影響。另一方面，本次研究存在一些不能測(cè)量的因素，如遺傳因素、飲食規(guī)律、環(huán)境因素等對(duì)血脂產(chǎn)生的影響，而且樣本量較少，可能存在一定的抽樣誤差，為了進(jìn)一步驗(yàn)證這種相關(guān)性，應(yīng)加大樣本量研究 。