呂錫斌，吳耀領(lǐng)，郝 飛，曾祥煉，張巧玲，陳良強(qiáng)，袁 頡，羅汝葉，楊 帆，王和玉，王 莉，尉洪濤，韓培杰，白逢彥

(1.貴州茅臺(tái)酒股份有限公司技術(shù)中心，貴州 仁懷 564501；2.中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，真菌學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101)

中國(guó)白酒是世界上最古老的蒸餾酒之一，在中國(guó)文化和人民日常生活中發(fā)揮著重要作用[1]。醬香型白酒作為中國(guó)基本香型之一的白酒，其獨(dú)特的傳統(tǒng)釀造工藝使得釀造體系中形成了復(fù)雜的微生物群落結(jié)構(gòu)，使其具有醬香突出、幽雅細(xì)膩、酒體醇厚、回味悠長(zhǎng)、空杯留香持久等特點(diǎn)。因此，研究醬香型白酒釀造過程微生物群落結(jié)構(gòu)，對(duì)解析醬香型白酒釀造機(jī)理、提高醬香型白酒產(chǎn)量及質(zhì)量具有重大意義。

醬香型白酒釀造的工藝特點(diǎn)為：兩次投料“下沙、造沙”、八次堆積發(fā)酵、九次蒸餾、七次取酒，最終由不同風(fēng)格特點(diǎn)的輪次酒長(zhǎng)期貯存，精心勾兌醞釀出高品質(zhì)的醬香白酒。下沙、造沙輪次是醬香型白酒釀造的基礎(chǔ)輪次，其工藝操作關(guān)系到后期輪次發(fā)酵過程中微生物的生長(zhǎng)繁殖[2]，同時(shí)下沙、造沙輪次酒醅中可累積更多的微生物代謝產(chǎn)物及產(chǎn)酒輪次所需醬香型白酒前體物質(zhì)，有利于后期輪次基酒香味物質(zhì)的形成[3-4]。因此了解和掌握下沙、造沙酒醅微生物的多樣性及其菌群變化，對(duì)揭示醬香型白酒獨(dú)特的香味物質(zhì)的形成機(jī)理，對(duì)保障后期輪次物料供給平衡和微生物代謝平衡，對(duì)醬香型白酒生產(chǎn)都至關(guān)重要，而目前對(duì)此的研究普遍較少。

本研究旨在通過Illumina Miseq PE300高通量測(cè)序平臺(tái)測(cè)序研究分析醬香型白酒下沙、造沙輪次發(fā)酵過程細(xì)菌16S rRNA和真菌ITS高變區(qū)，研究堆積、窖內(nèi)發(fā)酵酒醅中的微生物多樣性及其主要功能群落結(jié)構(gòu)，深入認(rèn)識(shí)發(fā)酵過程的微生物多樣性，解析制酒過程中細(xì)菌、真菌的組成、變化及其演替規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒醅：取自貴州茅臺(tái)酒股份有限公司制酒車間。

菌種：細(xì)菌、真菌培養(yǎng)基購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司。

耗材及試劑：菌株DNA提取、16S rDNA片段和真菌ITS擴(kuò)增所用的酶、Marker、dNTPs、Buffer等購(gòu)于生工生物上海股份有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

儀器設(shè)備：Illumina Miseq PE300高通量測(cè)序平臺(tái)測(cè)序；Vortex振蕩器，德國(guó)IKA公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 取樣方法

每個(gè)輪次醬香型白酒生產(chǎn)分為堆積發(fā)酵和窖內(nèi)發(fā)酵兩個(gè)階段。如圖1所示，在堆積發(fā)酵階段0 d、1 d、2 d、3 d酒醅樣品在堆積表面約20 cm深的D點(diǎn)取樣。入窖時(shí)，對(duì)A、B、C、D和E點(diǎn)的5個(gè)酒醅樣品進(jìn)行收集。在窖內(nèi)發(fā)酵過程中，對(duì)距離窖池邊緣約30 cm，深度約120 cm的D點(diǎn)酒醅樣品在發(fā)酵0 d、3 d、6 d、12 d、21 d、30 d以及出窖時(shí)進(jìn)行收集，用于細(xì)菌和真菌的高通量測(cè)序。

圖1 取樣點(diǎn)圖示

1.2.2 高通量測(cè)序分析方法

總體基因組DNA直接從樣本中提取[5]，利用Illumina Miseq PE300高通量測(cè)序平臺(tái)測(cè)序。細(xì)菌的16S rRNAV3—V4擴(kuò)增引物為338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和 806R（5'-GGACTACNNGGG TATCTAAT-3'），真 菌 擴(kuò) 增 引 物 為ITS3（5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）。PCR反應(yīng)體系：12.5 μL 2× Taq PCR MasterMix，3 μL BSA(2 ng/μL)，2 Primer(5 μM)，2 μL 模板 DNA,和5.5μL ddH2O。反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 變性45 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸45 s，32個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min終止。擴(kuò)增序列通過Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行Paired-end測(cè)序，下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過QIIME（v1.8.0）軟件過濾、拼接、去除嵌合體，去除得分低于20分、堿基模糊、引物錯(cuò)配或測(cè)序長(zhǎng)度小于150 bp的序列。

經(jīng)過上述步驟后，將標(biāo)簽分組具有97%序列相似性的高質(zhì)量的OTU序列[6-8]，細(xì)菌得到的每個(gè)OTU代表序列比對(duì)silva數(shù)據(jù)庫(kù)和NT數(shù)據(jù)庫(kù)，真菌得到的OTU代表序列比對(duì)UNITE數(shù)據(jù)庫(kù)和NT數(shù)據(jù)。最后再通過人工進(jìn)行檢查以獲得物種信息。稀疏曲線使用R語(yǔ)言繪制來(lái)評(píng)估微生物多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 Alpha多樣性分析

計(jì)算下沙（XS）、造沙（ZS）輪次Chao1指數(shù)以確定物種豐富度，Shannon指數(shù)以確定物種多樣性，pielou指數(shù)反映微生物個(gè)體數(shù)目分配的均勻程度，以描述堆積、窖內(nèi)發(fā)酵酒醅樣品中細(xì)菌、真菌群落的多樣性。

2.1.1 稀疏曲線分析（圖2）

由圖2可知，下沙、造沙輪次的樣品細(xì)菌、真菌稀疏曲線都趨向平坦，說(shuō)明各樣本細(xì)菌、真菌的測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，測(cè)序深度已足夠。

2.1.2 Shannon指數(shù)、Pielou指數(shù)分析（表1）

由表1可看出，下沙、造沙堆積發(fā)酵細(xì)菌及下沙堆積發(fā)酵真菌Shannon指數(shù)、pielou指數(shù)均高于窖內(nèi)發(fā)酵，說(shuō)明堆積樣品中微生物的多樣性及物種均勻程度高于窖內(nèi)發(fā)酵，造沙窖內(nèi)發(fā)酵真菌則反之。也說(shuō)明了同輪次不同發(fā)酵階段及不同輪次間的微生物多樣性存在一定差異。

注：XS：下沙；ZS：造沙；stack：堆積；pit：窖內(nèi)。

表1 不同發(fā)酵過程中酒醅樣品Shannon指數(shù)及Pielou指數(shù)

2.2 不同發(fā)酵時(shí)期微生物群落多樣性結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 下沙、造沙輪次細(xì)菌分類

對(duì)下沙（XS）、造沙（ZS）輪次發(fā)酵過程中酒醅樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在屬分類水平上的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比（相對(duì)豐度＜0.1%及未鑒定出的種類歸入“其他”），結(jié)果見表2。

表2 下沙、造沙發(fā)酵過程中酒醅主要細(xì)菌群類占比

對(duì)酒醅樣品中細(xì)菌群落的高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：下沙、造沙輪次分別檢測(cè)到203個(gè)、184個(gè)細(xì)菌屬。在下沙輪次發(fā)酵過程中乳酸菌為豐度最高的細(xì)菌，其中Lactobacillus(50.80%)、Weissella(25.08%)、Pediococcus(17.94%)、Lentibacillus(0.92%)、Kroppenstedtia(0.91%)為下沙輪次主要細(xì)菌屬；造沙輪次發(fā)酵過程中乳酸菌同為豐度最高的細(xì)菌屬，其中Lactobacillus(78.08%)、Pediococcus(6.57%)、Acetobacter(5.91%)、Lentibacillus(2.23%)、Bacillus(2.06%)、Kroppenstedtia(1.52%)、Oceanobacillus（1.42%）為造沙輪次主要細(xì)菌屬。

2.2.2 下沙、造沙輪次真菌分類（表3）

表3 下沙、造沙發(fā)酵過程中酒醅主要真菌群類占比(%)

下沙、造沙輪次分別檢測(cè)到160個(gè)、109個(gè)真菌屬。在下沙輪次發(fā)酵過程中畢赤酵母屬為豐度最高的真菌，其中Pichia(84.78%)、Saccharomyces(6.23%)、Thermoascus(1.95%)、Aspergillus(1.45%)、Monascus(0.8%)為下沙輪次主要真菌屬；造沙輪次主要真菌屬為Pichia(77.71%)、Saccharomyces(13.80%)、Thermoascus(2.65%)、Thermomyces(1.0%)、Aspergillus(0.67%)。

2.3 細(xì)菌、真菌的演替規(guī)律

2.3.1 下沙、造沙輪次發(fā)酵過程中細(xì)菌群落的演替規(guī)律分析（圖3、圖4）

圖3 下沙發(fā)酵過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化

圖4 造沙發(fā)酵過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化

下沙輪次堆積開始時(shí)，酒醅通過網(wǎng)羅大曲和環(huán)境獲得了豐富的微生物資源，其中Pediococcus acidilactici（27.82%）、Lentibacillus sp.（14.38%）、Thermoactinomyces sanguinis（11.11%）為優(yōu)勢(shì)菌，同時(shí)還有其他細(xì)菌種屬，如Weissella paramesenteroides（9.02%）、Oceanobacillus sp.（7.63%）、Bacillus amyloliquefaciens（7.53%）、Oceanobacillus indicireducens（3.41%）、Staphylococcus condimenti（3.33%）、Bacillus sp.（3.09%）、Kroppenstedtia eburnea（2.9%）、Lactobacillus plantarum（1.16%）等。經(jīng)高溫堆積發(fā)酵至發(fā)酵結(jié)束，不同取樣位置、堆積時(shí)間的微生物相對(duì)豐度略有波動(dòng)，優(yōu)勢(shì)菌主要為Weissella paramesenteroides、Pediococcus acidilactici、Lactobacillus plantarum等乳酸菌，且相對(duì)豐度為80%以上。

在窖內(nèi)發(fā)酵初期，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與堆積后期相近，至窖內(nèi)發(fā)酵7 d，菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化，Lactobacillus panis相對(duì)豐度增至76.21%，占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位。窖內(nèi)發(fā)酵結(jié)束，Lactobacillus panis豐度回落至51.92%，與Lactobacillus acetotolerans（34.66%）同為優(yōu)勢(shì)菌，同時(shí)有Pediococcus acidilactici（3.31%）、Lactobacillus plantarum（3.02%）、Lactobacillus pontis（1.93%）、Lactobacillus buchneri（1.47%）等均為乳酸菌。

造沙堆積開始時(shí)，Lentibacillus sp.（22.57%）、Bacillus amyloliquefaciens（14.72%）、Pediococcus acidilactici（10.94%）、Oceanobacillus sp.（10.01%）為優(yōu)勢(shì)菌，同時(shí)還有Thermoactinomyces sanguinis（9.23%）、Oceanobacillus indicireducens（4.15%）、Staphylococcus condimenti（3.02%）、Kroppenstedtia eburnea（3.0%）、Lactobacillus panis（2.22%）、Bacillus kokeshiiformis（2.06%）、Acetobacter ghanensis（1.91%）等。經(jīng)高溫堆積至發(fā)酵結(jié)束，優(yōu)勢(shì)菌主要為L(zhǎng)actobacillus panis、Pediococcus acidilactici、Acetobacter ghanensis，均為產(chǎn)酸微生物，且相對(duì)豐度為90%以上。

窖內(nèi)發(fā)酵的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化較大，發(fā)酵初期Lactobacillus panis相對(duì)豐度為76.22%，為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌，窖內(nèi)厭氧發(fā)酵過程中Lactobacillus panis、Lactobacillus sp.、Lactobacillus acetotlerans呈現(xiàn)升高后降低的趨勢(shì)，至窖內(nèi)發(fā)酵結(jié)束，Lactobacillus sp.（78.62%）、Lactobacillus acetotolerans（16.07%）、Lactobacillus panis（3.86%），乳酸菌成為優(yōu)勢(shì)菌，相對(duì)豐度為98%以上。

2.3.2 下沙、造沙輪次發(fā)酵過程中真菌群落的演替規(guī)律分析（圖5、圖6）

圖5 下沙發(fā)酵過程中真菌群落結(jié)構(gòu)變化

下沙輪次真菌微生物多樣性比較單一，從下沙堆積至窖內(nèi)發(fā)酵結(jié)束，Pichia kudriavzevii是絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌株。堆積0 d至堆積發(fā)酵結(jié)束，Pichia kudriavzevii相對(duì)豐度由41.28%升至91.28%，Saccharo-myces cerevisiae則先升后降至1.63%。窖內(nèi)發(fā)酵階段真菌群落結(jié)構(gòu)變化不大，到發(fā)酵結(jié)束，Pichia kudriavzevii（89.56%）、Pichia manshurica（7.74%）為優(yōu)勢(shì)菌，Saccharomyces cerevisiae降至1.35%。

圖6 造沙發(fā)酵過程中真菌群落結(jié)構(gòu)變化

造沙輪次發(fā)酵過程中Pichia kudriavzevii在窖內(nèi)發(fā)酵結(jié)束降至48.78%，Saccharomyces cerevisiae先升后降至22.32%，Pichia manshurica則升高至14.67%。但整體與下沙輪次發(fā)酵過程相比，Pichia kudriavzevii相對(duì)豐度下降明顯，Saccharomyces cerevisiae與Pichia manshurica均有較大幅度增長(zhǎng)。

2.4 不同輪次不同發(fā)酵階段主成分分析（Principal component analysis）（圖7、圖8）

圖7 不同發(fā)酵階段細(xì)菌主成分分析

通過主成分分析，將多維變量降維成兩個(gè)變量進(jìn)行分析，細(xì)菌群落第一主成分（PC1）貢獻(xiàn)率達(dá)46.1%，第二主成分（PC2）貢獻(xiàn)率達(dá)27.7%；真菌群落第一主成分（PC1）貢獻(xiàn)率達(dá)93.1%，第二主成分（PC2）貢獻(xiàn)率達(dá)4.4%。結(jié)果顯示，下沙堆積、窖內(nèi)及造沙堆積、窖內(nèi)各自聚為一類，說(shuō)明不同輪次不同發(fā)酵階段菌群結(jié)構(gòu)及微生物多樣性存在顯著差異（p＜0.05）。

圖8 不同發(fā)酵階段真菌主成分分析

3 結(jié)論

本研究基于醬香型白酒下沙、造沙輪次酒醅高通量測(cè)序結(jié)果對(duì)其堆積發(fā)酵及窖內(nèi)發(fā)酵過程中的細(xì)菌、真菌多樣性進(jìn)行了分析。

下沙、造沙分別檢測(cè)到細(xì)菌203個(gè)屬和184個(gè)屬，乳酸菌為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌貫穿了下沙、造沙堆積發(fā)酵，窖內(nèi)發(fā)酵的整個(gè)過程，說(shuō)明了乳酸菌對(duì)醬香型白酒發(fā)酵的重要性。在堆積發(fā)酵結(jié)束，Weissella paramesenteroides、Pediococcus acidilactici、Lactobacillus panis占比可達(dá)80%以上，窖內(nèi)發(fā)酵結(jié)束，Lactobacillus panis、Lactobacillus sp.、Lactobacillus acetotolerans占比可達(dá)90%以上。而清香型白酒發(fā)酵過程中優(yōu)勢(shì)乳酸菌比較單一，Lactobacillus fuchuensis相對(duì)豐度始終保持在較高的水平[9]；濃香型白酒發(fā)酵過程中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位的是Lactobacillus acetotolerans，其在發(fā)酵3 d后相對(duì)豐度可占整個(gè)乳酸菌屬98%以上，并持續(xù)至發(fā)酵結(jié)束[10-12]。

下沙、造沙分別檢測(cè)到真菌160個(gè)屬和109個(gè)屬，優(yōu)勢(shì)菌屬均為酵母菌，下沙期間，Pichia kudriavzevii為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌，占比在90%左右，造沙窖內(nèi)發(fā)酵時(shí)，Saccharomyce scerevisiae大量繁殖，至窖內(nèi)發(fā)酵結(jié)束達(dá)到22.32%，Pichia kudriavzevii占比仍達(dá)48.78%。下沙、造沙輪次是醬香型白酒的非產(chǎn)酒輪次，酵母菌作用則主要表征在產(chǎn)香及產(chǎn)前體物質(zhì)方面[13-15]。Saccharomyces cerevisiae是白酒發(fā)酵過程中的主要產(chǎn)酒微生物，在不同香型的發(fā)酵過程中都不可或缺[16-17]，但其在醬香型白酒造沙窖內(nèi)發(fā)酵期間才大量生長(zhǎng)，占比可達(dá)20%～40%之間。Pichia kudriavzevii、Pichia membranifaciens、Candida krusei、Zygosaccharomyces bailii等均對(duì)酸、醇具有較強(qiáng)酯化能力，產(chǎn)生的物質(zhì)對(duì)酒體風(fēng)格形成具有重要作用[16，19-23]，其中Pichia kudriavzevii在不同香型白酒發(fā)酵過程中的演替規(guī)律存在顯著差異，在醬香型白酒發(fā)酵過程中其相對(duì)豐度最高可達(dá)95%以上，清香型白酒發(fā)酵起始時(shí)，Pichia kudriavzevii相對(duì)豐度最大(85.12%)，到發(fā)酵20 d豐度降至最小(32.85%)，至發(fā)酵結(jié)束升至43.29%[18]；濃香型白酒占主體地位的主要為Saccharomyces cerevisiae[24-25]。

由此可見，白酒發(fā)酵過程中主要微生物菌群結(jié)構(gòu)的差異是造成不同香型白酒差異明顯的因素之一，也是醬香型白酒不同輪次間白酒香氣成分差異的主要因素。但是目前仍不清楚不同乳酸菌、酵母菌間相互作用對(duì)于白酒釀造過程的影響，且醬香型白酒發(fā)酵過程中溫度、酒醅糊化程度、水分、淀粉、酸度、微生物間相互作用等的變化均為影響微生物生長(zhǎng)代謝的環(huán)境因素，從而形成不同發(fā)酵階段微生物多樣性的差異。因此，后續(xù)將在下沙、造沙輪次微生物多樣性和演替規(guī)律的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步結(jié)合可培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)對(duì)發(fā)酵過程中微生物的功能及相互作用進(jìn)行研究，為更好地揭示醬香型白酒釀造機(jī)理和控制白酒品質(zhì)提供生物學(xué)依據(jù)。