邱雪迎，馬丹丹，趙偉全，李壽如，賈景麗，劉大群，3

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護學(xué)院/河北省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程技術(shù)研究中心，河北 保定 071001； 2.本溪市馬鈴薯研究所，遼寧 本溪 117000； 3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 研究生院，北京 100081)

馬鈴薯是位列小麥、水稻和玉米后的第四大主糧作物，在保證我國糧食安全和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展方面具有重要作用。我國馬鈴薯的常年種植面積在560萬hm2以上，總產(chǎn)量保持在9 000萬t以上[1]，是世界生產(chǎn)和消費第一大國。隨著我國馬鈴薯種植面積的逐年增加，病害對馬鈴薯生產(chǎn)的影響日益突出，其中馬鈴薯瘡痂病作為典型的土傳與種傳病害，已在我國各馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，呈現(xiàn)逐年增長的趨勢[2]。目前已知馬鈴薯瘡痂病可由多種植物病原鏈霉菌(Plant-pathogenicStreptomyces)引起，包括普通瘡痂鏈霉菌(S.scabies)[3]、酸性瘡痂鏈霉菌(S.acidiscabies)[4]、腫脹瘡痂鏈霉菌(S.turgidiscabies)[5]等10余種致病種，且不同致病種間的生物學(xué)特征有較大差別[6]。馬鈴薯瘡痂病的發(fā)生與生長環(huán)境有很大關(guān)系，尤其在重復(fù)使用蛭石為基質(zhì)生產(chǎn)微型薯過程中，瘡痂病的發(fā)病率很高，危害較重。有調(diào)查表明，在內(nèi)蒙古18個種薯生產(chǎn)單位瘡痂病的發(fā)病率高達83.0%[7]。盡管目前有些措施可有效預(yù)防微型薯瘡痂病，如利用霧培法、無土栽培等方式生產(chǎn)，但由于對技術(shù)設(shè)施要求較高和需要投入生產(chǎn)成本較多，很多生產(chǎn)單位較難采用，因此，多數(shù)還是以蛭石為基質(zhì)進行微型薯生產(chǎn)。鑒于目前尚缺乏防治蛭石基質(zhì)中馬鈴薯瘡痂病的有效手段，本研究對蛭石基質(zhì)中的瘡痂病原菌進行鑒定，針對病原菌篩選有效的抑菌藥劑，并結(jié)合前期獲得的生防制劑在蛭石苗床上進行菌藥協(xié)同防治試驗，旨在探索馬鈴薯瘡痂病防治的新途徑。

1 材料和方法

1.1 供試菌株和菌劑

供試菌株包括分離自遼寧本溪微型薯病斑上的瘡痂病原鏈霉菌LNB-1、LNB-2、LNB-3，已全部完成柯赫氏法則驗證，均為瘡痂病致病菌株；瘡痂病原鏈霉菌S.scabies的典型菌株CPS-1；生防菌劑ZWQ-1水劑為前期制備，活菌含量為1.0×109cfu/mL。

1.2 供試藥劑

所用測試藥劑共29種，具體信息見表1。

表1 29種藥劑的有效成分、含量及生產(chǎn)廠家Tab.1 The active components,contents and manufacturers of 29 pesticides

續(xù)表1 29種藥劑的有效成分、含量及生產(chǎn)廠家Tab.1(Continued) The active components,contents and manufacturers of 29 pesticides

1.3 微型薯瘡痂病原菌的分子鑒定

采用CTAB法[8]提取3個菌株的基因組DNA，采用鏈霉菌16S rRNA基因的通用引物16S1(5′-CATTCACGGAGAGTTTGATCC-3′)和16S2( 5′-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC- 3′)擴增，將獲得的片段交由上海生工生物工程有限公司測序。序列經(jīng)校對后，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對分析，選取相似性較高的菌株和瘡痂病原鏈霉菌的典型菌株，利用MEGA 5.0軟件對16S rRNA基因序列進行聚類分析，通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹對菌株進行分子鑒定。

1.4 皿內(nèi)抑菌藥劑與菌藥協(xié)同組合篩選

采用紙碟法[9]進行皿內(nèi)抑菌藥劑篩選。將馬鈴薯瘡痂病菌S.scabies菌株CPS-1制成105cfu/mL的孢子懸浮液，用微量移液器吸取30 μL涂布OMA平板，在培養(yǎng)皿中央放置直徑6 mm的無菌濾紙片，分別將29種測試藥劑用無菌水配制成不同初篩濃度(表1)，取5 μL加至培養(yǎng)皿的濾紙片上，于28 ℃倒置培養(yǎng)5 d后測量抑菌圈大小，每種藥劑3次重復(fù)，以無菌水為對照。根據(jù)結(jié)果將活性較好的藥劑稀釋成不同的濃度梯度，采用紙碟法進行最低有效濃度測定(方法同前)。然后將有抑菌效果的藥劑與ZWQ-1生防菌劑進行組合培養(yǎng)測試，確定可協(xié)同使用的藥劑。

1.5 微型薯苗床防治試驗

防治試驗在遼寧本溪馬鈴薯研究所日光溫室的微型薯擴繁苗床中進行，測試所用馬鈴薯品種為春季收獲的尤金試管苗原原種，所用基質(zhì)為春季使用過且有瘡痂病發(fā)生的舊蛭石。每個苗床長8.0 m、寬1.5 m，每個小區(qū)2.0 m2。按照行距6.0 cm、株距5.0 cm、播種深度10.0 cm種植。選用室內(nèi)藥劑篩選中有明顯抑菌效果的藥劑進行處理，以清水處理為對照。在馬鈴薯齊苗后，株高8.0 cm左右開始施藥，此后每隔7 d處理1次，共處理3次。每次處理時將藥劑用10 L水充分溶解后灌根，其他管理照常，微型薯成熟后收獲并分別調(diào)查發(fā)病情況。

馬鈴薯瘡痂病分級標(biāo)準(zhǔn)：0級，薯塊表面無病斑；1級，病斑面積占薯塊面積≤5%；2級，病斑面積占薯塊面積的5%～10%；3級，病斑面積占薯塊面積的10%～20%；4級，病斑面積占薯塊面積的20%～40%；5級，病斑面積占薯塊面積的40%～65%；6級，病斑面積占薯塊面積的65%以上。

發(fā)病率=發(fā)病粒數(shù)/收獲小薯粒數(shù)×100%，病情指數(shù)=∑(病級粒數(shù)×發(fā)病級別)/(調(diào)查收獲粒數(shù)×發(fā)病最高級別)×100，防治效果=(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 微型薯瘡痂病菌的分子鑒定結(jié)果

通過對瘡痂病菌LNB-1、LNB-2和LNB-3進行基因組DNA提取，利用引物16S1/16S2擴增后，得到約1.5 kb的擴增產(chǎn)物，經(jīng)回收測序和序列校對后，確定片段長度為1 460 bp。在 NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行BLAST分析發(fā)現(xiàn)，3個菌株與S.scabies最為相似，同源性均大于99%，通過構(gòu)建不同瘡痂病菌16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，確定獲得的3個菌株均屬于S.scabies(圖1)。

A：16S rRNA基因擴增(M：Marker；1：LNB-1 菌株；2：LNB-2 菌株；3：LNB-3菌株)；B：系統(tǒng)發(fā)育樹 A: 16S rRNA gene amplification (M: Marker; 1: LNB-1 strain; 2: LNB-2 strain; 3: LNB-3 strain)； B: Phylogenetic tree圖1 瘡痂病菌16S rRNA基因擴增及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建結(jié)果Fig.1 16S rRNA gene amplification and phylogenetic tree construction of scab pathogen

2.2 室內(nèi)抑菌藥劑篩選結(jié)果

采用濾紙片法對29種藥劑進行初步測試，發(fā)現(xiàn)對瘡痂病菌CPS-1抑制效果較好的藥劑有8種。對這8種藥劑所含有效成分的最低有效濃度進行梯度篩選，結(jié)果表明，適樂時0.1 g/L的抑菌圈直徑最大，為41 mm；其次為福美雙0.35 g/L、百菌清0.28 g/L和72%農(nóng)用鏈霉素0.56 g/L，其抑菌圈直徑分別為39 mm、39 mm和36 mm；四霉素0.1 g/L、氰烯菌酯0.125 g/L、三唑酮0.1 g/L和億度勇0.2 g/L的抑菌效果相對較差，抑菌圈直徑分別為25 mm、24 mm、22 mm和14 mm(圖2)；其余21種藥劑抑菌效果很差。將獲得的8種藥劑與生防菌劑ZWQ-1水劑進行組合培養(yǎng)測試，結(jié)果表明，適樂時和福美雙可以與生防菌劑共同使用。

2.3 微型薯苗床防治試驗結(jié)果

將篩選到的菌藥協(xié)同組合、其他抑菌藥劑、ZWQ-1水劑、檸檬酸及農(nóng)用EDTA等用于微型薯苗床防治試驗。在收獲前對植株生長情況調(diào)查(圖3)發(fā)現(xiàn)，清水對照有較多植株枯死；ZWQ-1水劑和福美雙+ZWQ-1水劑處理的植株長勢良好；而72%農(nóng)用鏈霉素、適樂時+ZWQ-1水劑、百菌清、檸檬酸和四霉素等處理均有部分植株出現(xiàn)黃化和死亡，但整體上植株生長狀況好于對照區(qū)；農(nóng)用EDTA、億度勇、氰烯菌酯和三唑酮處理植株均有大面積死亡發(fā)生，分析原因可能與施藥后未能及時沖洗掉葉片殘留的藥劑有關(guān)。瘡痂病的防效評價是對新生薯塊的發(fā)病情況進行調(diào)查，植株的損傷對防效的影響相對較小，因此試驗可以繼續(xù)進行。待微型薯全部收獲后，對所有薯塊進行統(tǒng)計分析的結(jié)果表明：清水對照薯塊發(fā)病率為70.90%；適樂時+ZWQ-1水劑和福美雙+ZWQ-1水劑處理的發(fā)病率分別為26.23%和30.83%，對病害的防治效果分別為72.60%和57.92%；ZWQ-1水劑、百菌清、四霉素和檸檬酸處理的發(fā)病率分別為47.47%、52.31%、62.16%和66.67%，防效均較低，分別為33.26%、23.68%、24.75%和19.11%；其余處理效果均很差(表2)。說明藥劑適樂時和福美雙與ZWQ-1水劑協(xié)同使用對瘡痂病具有明顯的防治效果，較具應(yīng)用潛力。

A：褔美雙0.35 g/L； B：農(nóng)用鏈霉素0.56 g/L；C：適樂時0.1 g/L；D：四霉素0.1 g/L；E：氰烯菌酯0.125 g/L；F：億度勇0.2 g/L；G：三唑酮0.1 g/L；H：百菌清0.28 g/L A: Thiram 0.35 g/L； B：Streptomycin 0.56 g/L；C：Shileshi 0.1 g/L；D：Fourmycin 0.1 g/L；E：Cyanenide 0.125 g/L；F：Yiduyong 0.2 g/L；G：Three azolone 0.1 g/L；H：Chlorothalonil 0.28 g/L圖2 不同藥劑對瘡痂病菌CPS-1菌株的抑菌測試結(jié)果Fig.2 Antibacterial test results of different agents against the CPS-1 strain

圖中為生長后期的植株長勢與收獲后隨機抽取的新生微型薯樣品，各處理分別為A：清水對照；B：ZWQ-1菌劑；C：72%農(nóng)用鏈霉素； D：適樂時+ZWQ-1水劑；E:百菌清；F：福美雙+ ZWQ-1水劑；G：檸檬酸；H：EDTA；I：四霉素；J：億度勇；K：氰烯菌酯；L：三唑酮Picture shows the plant growth at the late growth stage and a random sample of new-born micro-potatoes taken after harvest. The treatments were as follows, A: Clear water control; B: ZWQ-1 water agent; C: 72% Streptomycin; D: Shileshi + ZWQ-1; E: Chlorothalonil; F: Thiram +ZWQ-1; G: Citric acid; H: EDTA； I: Fourmycin; J: Yiduyong; K: Cyanenide； L: Three azolone圖3 微型薯收獲時不同處理植株生長與瘡痂病發(fā)生情況Fig.3 The plant growth and minituber scab occurrence state of different treatments at harvest time

處理 Treatments每升用量Dosage in 1 L各病級微型薯粒數(shù)Minituber number of each disease grade012 3456發(fā)病率/%Morbidity病情指數(shù)Disease index防治效果/% Control efficiencyZWQ-1水劑ZWQ-1 water agent0.25 L104252220186347.4729.9633.26b72%農(nóng)用鏈霉素72% Streptomycin6.0 g281289521258.8234.4814.28c適樂時+ZWQ-1水劑Shileshi+ZWQ-15.0 mL+0.25 L90127454226.2312.3072.60a百菌清Chlorothalonil25.0 g10311231518163052.3134.2623.68bc福美雙+ZWQ-1水劑Thiram+ZWQ-120.0 g+0.25 L8345778630.8318.8957.92a檸檬酸Citric acid150.0 g411818912111466.6736.3119.11bcEDTA 70.0 g201296781072.2240.749.24c四霉素Fourmycin5.0 mL28713855862.1633.7824.75bc億度勇Yiduyong2.0 g2331384854.0038.0015.35c氰烯菌酯 Cyanenide8.0 mL94181588586.5746.52—三唑酮Three azolone6.0 mL4328661290.2463.82—清水對照Clear water control—559281729292270.9044.89

注：同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note:Different letters in the same column indicate significant difference (P<0.05).

3 結(jié)論與討論

隨著馬鈴薯種植面積的增加和多年連作，馬鈴薯瘡痂病的發(fā)生日益加重，已成為馬鈴薯生產(chǎn)的主要問題。馬鈴薯瘡痂病發(fā)生的隱蔽性較強，給防治帶來較大困難。在以蛭石基質(zhì)生產(chǎn)微型薯時，由于其形成的特殊環(huán)境非常有利于瘡痂病發(fā)生，致使微型薯的發(fā)病率非常高。目前對該病害的發(fā)生機制和影響因素還不十分清楚，僅知其具有土傳和種傳病害的基本特征。對該病害的防治還停留在多方探索階段，人們在抑菌藥劑、施藥方法及生物因子防治等方面進行了研究。李青青等[10]通過澆灌防治的方法發(fā)現(xiàn)，53.8%可殺得2000的600倍液對脫毒薯瘡痂病的防效為51.37%，20%五氯硝基苯可濕性粉劑1 000倍液的防效為39.75%。于勤良等[11]發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)用氯化苦熏蒸處理，帶病種薯播種前用0.1%對苯二酚處理30 min，防效較好。李玉聰?shù)萚12]獲得1株對馬鈴薯瘡痂病菌具有較強拮抗作用的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)，并將其用于溫室盆栽防治試驗，測試其防效為40.27%～48.66%。劉萍萍[13]采用生防鏈霉菌CC5-6菌懸液在盆栽試驗薯塊形成初期灌根防治馬鈴薯瘡痂病，防治效果為33.9%。奚啟新等[14]發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)土壤pH值至5.0以下或7.69以上對瘡痂病菌有一定抑制作用。此外，還有很多其他措施被用于探索馬鈴薯瘡痂病的防治，如消毒、調(diào)節(jié)不同基質(zhì)、施用生物有機肥等[15-19]。

盡管多種措施在馬鈴薯微型薯瘡痂病防治方面已經(jīng)取得一定的效果，但防效普遍不高，說明單純利用一種措施防治很難達到理想的效果。此外，由于馬鈴薯瘡痂病可由多種病原鏈霉菌引起，在防治中確定病原菌的種類是重要前提，以便開展針對性防治。因此，本研究中首先對微型薯苗床的瘡痂病原種類進行了鑒定，確定為致病種S.scabies后再針對其篩選抑菌藥劑，并結(jié)合前期獲得的生防菌株[20]形成菌藥協(xié)同組合，確定用量后進行苗床防治試驗。結(jié)果顯示，適樂時、福美雙分別與生防菌劑ZWQ-1水劑的組合處理可顯著降低瘡痂病的發(fā)病程度，防效為72.60%和57.92%，而單純使用ZWQ-1水劑的防效與其他報道的效果相差不大，為33.26%。此外，菌藥協(xié)同處理對微型薯植株生長表現(xiàn)出較好的促進作用。說明在馬鈴薯瘡痂病防治中將生防制劑和化學(xué)藥劑恰當(dāng)組合使用會取得防病、促生長的雙重效果。本研究為馬鈴薯瘡痂病的防治探索了一條新途徑，具體菌藥協(xié)同防病促生的原因和作用機制還有待進一步研究。