田志龍，潘林香，王金文，馬 琳，儲明星

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京 100193；2.萊蕪市嬴泰有機農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司，山東 萊蕪 271114；3.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，濟南 250100）

綿羊的產(chǎn)羔數(shù)直接受排卵數(shù)影響，而在卵泡發(fā)育過程存在多方面因素影響排卵數(shù)。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β/SMADs信號通路在哺乳動物的卵巢卵泡的發(fā)育、卵泡的選擇與閉鎖過程中發(fā)揮著極其重要的調(diào)控作用［1］。在這一過程中，該通路中的關(guān)鍵成員（配體、受體、信號分子等）在整個生殖系統(tǒng)中都有協(xié)調(diào)的時空表達模式、控制和調(diào)節(jié)卵巢的生理學(xué)功能［2］。SMAD1作為TGF-β/SMADs信號通路下游重要的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛分布于不同的組織并介導(dǎo)多種類型的生理過程［3］。雌激素是一類具有廣泛生物學(xué)效應(yīng)的類固醇激素，主要由卵巢和胎盤分泌產(chǎn)生。雌激素與ESR結(jié)合可引發(fā)基因組效應(yīng)或非基因組效應(yīng)，從而影響細胞的功能［4］。研究表明，ESR2通過直接對卵巢作用和在下丘腦-垂體-卵巢軸的負反饋兩條途徑調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育和排卵［5］；ESR2敲除的小鼠卵巢有腔卵泡和黃體數(shù)量降低且趨向閉鎖和凋亡，導(dǎo)致卵泡成熟和排卵受限制，最終降低動物繁殖能力［6］。

魯中肉羊是近期在山東地區(qū)培育的綿羊新類群，具有飼料報酬高、耐粗飼、抗病、適合舍飼圈養(yǎng)等特點［7］。本試驗以此為研究對象，利用本實驗團隊前期重測序結(jié)果結(jié)合Sequenom MassARRAY?SNP技術(shù)進行SNP分型檢測，并使用SPSS軟件分析產(chǎn)羔數(shù)和多態(tài)性之間的關(guān)系，以期為綿羊分子標記輔助育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

384只魯中肉羊血液樣品采自萊蕪市嬴泰有機農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司，同時記錄魯中肉羊產(chǎn)羔數(shù)、胎次和產(chǎn)羔季節(jié)等信息。頸靜脈采血，檸檬酸葡萄糖抗凝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA提取

試驗綿羊血液樣本DNA提取使用天根血液DNA試劑盒，并使用Nano Drop 2000檢測DNA樣本濃度，通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳對DNA質(zhì)量進行檢測。

1.3 基因分型

對SMAD1基因g.12485895A＞G位點和ESR2基因g.73324006C＞T位點在魯中肉羊中進行基因分型，采用Sequenom MassARRAY?SNP 技術(shù)［8-9］進行基因型檢測。分型樣品為DNA，每個樣品需要量20 μL，DNA濃度40～80 ng/μL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用 Microsoft Excel 2013統(tǒng)計g.12485895A＞G位點的基因頻率、基因型頻率、多態(tài)信息含量（PIC）、雜合度（He）和有效等位基因數(shù)（Ne），隨后進行哈代溫伯格檢驗。產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)分析參考田志龍等［10］的方法。用SPSS19.0軟件程序中一般線性模型完成魯中肉羊基因型與產(chǎn)羔表型數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)分析，所有數(shù)據(jù)以平均值±標準誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA檢測

提取魯中肉羊血液總DNA，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，DNA條帶清晰，無降解（圖1）。Nanodrop 2000檢測DNA的A260/A280為1.8～2.0，表明提取的DNA的純度較高，可用于后續(xù)試驗。

圖1 DNA檢測

2.2 群體遺傳學(xué)分析

通過基因分型發(fā)現(xiàn)，SMAD1基因g.12485895A＞G位點共有3種基因型，分別是AA、AG和GG（圖2）。其中，GG基因型為優(yōu)勢基因型，G為優(yōu)勢等位基因。ESR2基因g.73324006C＞T位點存在CC和CT兩種基因型，其中CC型為優(yōu)勢基因型，C為優(yōu)勢等位基因。從表1可知，SMAD1基因g.12485895A＞G位點在魯中肉羊群體中表現(xiàn)為中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5），卡方適合性檢驗結(jié)果表明，該位點在魯中肉羊中處于哈代溫伯格不平衡狀態(tài)（P＜0.05）。ESR2基因 g.73324006C＞T位點在魯中肉羊群體中表現(xiàn)為低度多態(tài)（PIC＜0.25），卡方適合性檢驗結(jié)果表明，該位點在魯中肉羊中處于哈代溫伯格平衡狀態(tài)（P＞0.05）。

2.3 產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)分析

由表2可知，SMAD1基因g.12485895A＞G位點不同基因型與魯中肉羊產(chǎn)羔數(shù)之間無顯著關(guān)聯(lián)（P＞0.05）。ESR2基因g.73324006C＞T位點中CC型母羊產(chǎn)羔數(shù)顯著高于 CT型（P＜0.05）。

圖2 SMAD1和ESR2基因分型結(jié)果

表1 SMAD1和ESR2基因多態(tài)位點的群體遺傳學(xué)分析

表2 SMAD1和ESR2基因不同位點與魯中肉羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系

3 討論

3.1 SMAD1基因多態(tài)性與動物繁殖性能的關(guān)系

現(xiàn)階段關(guān)于SMAD1基因多態(tài)性與動物繁殖的報道多集中于水生動物，在哺乳動物中的研究較少。池秋蝶等［11］通過外顯子測序獲得文蛤Smad1基因多態(tài)信息，并發(fā)現(xiàn)其多態(tài)性可以影響文蛤的生長發(fā)育。對g.12485895A＞G位點進行基因定位研究發(fā)現(xiàn)，該位點處于SMAD1基因第2內(nèi)含子區(qū)域。關(guān)于內(nèi)含子變異影響動物表型的報道很多。

在 揚 州 鵝 的 研 究 中 發(fā) 現(xiàn)［12］，KIAA1462 基 因 的rs1714766362突變和啟動子區(qū)域的c.-413C＞G突變緊密連鎖，可以通過調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素受體的結(jié)合親和力，影響鵝的產(chǎn)蛋性。皖江白鵝SMAD9基因內(nèi)含子2的C＞T變異，顯著影響其產(chǎn)蛋性能［13］。秦川牛SMAD3基因內(nèi)含子 3（g.101664C＞G）和內(nèi)含子 5（g.114523A＞G）變異顯著影響其體重、胸圍和臀部長度［14］（P＜0.05）。這些研究表明，內(nèi)含子變異不僅影響轉(zhuǎn)錄和剪接過程，還可以通過控制基因表達來調(diào)控動物表型。Xu等［15］研究發(fā)現(xiàn)，位于SMAD1基因內(nèi)含子區(qū)域的rs40635766突變與湖羊繁殖力密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，SMAD1基因g.12485895A＞G位點在魯中肉羊處于中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5），卡方檢驗顯示，該位點在魯中肉羊群體屬于哈代溫伯格不平衡狀態(tài)（P＜0.05）。這和該群體仍處于持續(xù)選育階段有關(guān)，人工選擇使得該位點處于哈代溫伯格不平衡狀態(tài)（P＜0.05）。關(guān)聯(lián)分析顯示，g.12485895A＞G位點與魯中肉羊產(chǎn)羔數(shù)沒有顯著關(guān)聯(lián)（P＞0.05）。

3.2 ESR2基因多態(tài)性與動物繁殖性能的關(guān)系

國內(nèi)外許多研究證實，ESR基因是調(diào)控豬高產(chǎn)仔數(shù)的主效基因之一［16］。Hewitt等［17］在小鼠中的研究結(jié)果表明，敲除ESR基因后將導(dǎo)致小鼠LH激素調(diào)節(jié)紊亂、卵巢不排卵等現(xiàn)象。對小尾寒羊［18］和湖羊［19］的研究表明，ESR基因與綿羊多羔繁殖性狀緊密相關(guān)。郭海燕等［20］利用PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術(shù)及基因測序技術(shù)對湖羊ESR基因多態(tài)性進行了檢測，并與湖羊產(chǎn)羔數(shù)進行了關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果在ESR基因第1外顯子363位發(fā)現(xiàn)C＞G突變，但是該突變不能顯著影響湖羊產(chǎn)羔數(shù)。本研究發(fā)現(xiàn)，ESR2基因g.73324006C＞T位點在魯中肉羊處于低度多態(tài)（PIC＜0.25），卡方檢驗顯示，該位點在魯中肉羊群體屬于哈代溫伯格平衡狀態(tài)（P＞0.05）；關(guān)聯(lián)分析顯示，g.73324006C＞T位點多態(tài)性與魯中肉羊平均產(chǎn)羔數(shù)顯著相關(guān)（P＜0.05），且CC型母羊產(chǎn)羔數(shù)顯著高于CT型母羊，說明該突變在一定程度上改變了產(chǎn)羔數(shù)，基因定位發(fā)現(xiàn)g.73324006C＞T位點在ESR2基因第8外顯子上，并導(dǎo)致精氨酸突變?yōu)榻M氨酸。猜測是由于該位點突變導(dǎo)致蛋白發(fā)生變化，影響ERβ發(fā)揮生理功能，最終導(dǎo)致綿羊產(chǎn)羔數(shù)發(fā)生變化。

4 結(jié)論

SMAD1基因g.12485895A＞G位點與魯中肉羊產(chǎn)羔性狀無關(guān)，ESR2基因g.73324006C＞T位點對魯中肉羊產(chǎn)羔數(shù)性狀的選育具有一定的指導(dǎo)意義。