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(1.西南民族大學生命科學與技術學院,四川成都 610041; 2.四川省農業(yè)科學院分析測試中心,四川成都 610066)

克羅諾桿菌(Cronobacterspp.)是近年來倍受關注的重要食源性致病菌?？肆_諾桿菌是一種周生鞭毛、有運動能力、無芽孢、兼性厭氧的革蘭氏陰性桿菌[1]。感染該菌可引起膿毒血癥和菌血癥,甚至會引起呼吸道、泌尿道、創(chuàng)傷傷口的感染,以及新生嬰幼兒的腦膜炎、菌血癥和小腸結腸炎等嚴重疾病,致死率高達30%～80%[2]。

不同阪崎克羅諾桿菌的毒力存在差異[3]?？肆_諾桿菌的外膜蛋白X(Outer membrane protein X,OmpX)是克羅諾桿菌毒力決定因子之一[4],參與宿主細胞的侵襲[5],抵御宿主細胞防御機制,其編碼基因為ompX。溶血素(Hemolysin,Hly)是另外一種有溶血活性的蛋白,其編碼基因為hly[6]?？肆_諾桿菌血漿纖溶酶原激活物(Cronobacter plasminogen activator,Cpa)可以保護克羅諾桿菌免受補體依賴性血清的殺傷并對纖溶酶原有活化作用,其編碼基因為cpa[7]。免疫相關蛋白(Siderophore-interacting protein,Sip)也與克羅諾桿菌的致病性相關[6]。另外,當細菌在物體表面附著時,為了適應周圍環(huán)境和提高生存能力,可以形成與浮游細菌不同的生存方式,稱之為生物被膜[8]?？肆_諾桿菌具有廣泛的生存溫度范圍及抗?jié)B透壓能力強的特征,其生物被膜形成能力也較強,保護其在食品加工環(huán)節(jié)廣泛生長并進行傳播,對食品安全帶來隱患[9]。已經從多種食品中分離出阪崎克羅諾桿菌,包括奶及奶制品、肉類、大米和其他谷物、蔬菜、發(fā)酵制品、豆制品、巧克力等[3]。近年來隨著克羅諾桿菌耐藥性報道不斷增加,有關該菌的耐藥性問題也越來越引起重視[10-13]。

本實驗從成都市市場、路邊小攤等采集食品樣品,分離并鑒定食品中污染的克羅諾桿菌,對其生物被膜成膜情況、攜帶的毒力基因和耐藥性進行檢測,為本地區(qū)克羅諾桿菌的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Coster96孔平底細胞培養(yǎng)板 美國康寧公司;胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)、阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基(DFI) 杭州微生物試劑有限公司;Mueller-Hinton 瓊脂(MHA)、緩沖蛋白胨水(BPW緩沖液)、改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬古霉素(mLST-Vm) 青島高科園海博生物技術有限公司;PCR試劑、2×TSINGKE Master Mix 成都擎科梓熙生物技術有限公司;各種抗生素含藥紙片 美國Oxiod Limited公司;克羅諾桿菌ATCC 29544 上海復祥生物科技有限公司。

PTC-200 PCR儀、Universal Hood II型凝膠成像儀 Bio-Rad公司;elx808酶標儀 美國biotek公司;UV-6100分光光度計 上海美普達儀器有限公司;WD800B型微波爐 順德市格蘭仕微波爐電器有限公司;5804R型Eppendorf 冷凍離心機 Eppendorf 中國有限公司;DYY-6C型電泳儀 北京六一儀器廠;GHP-9080水式恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學儀器有限公司;HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱 江蘇省太倉市實驗設備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品采集 在成都市附近的農貿市場和路邊小攤共采集生鮮食品樣品129份,其中菜市場118份,路邊攤11份。樣品包括:涼拌即食類40份,鹵制類27份,米面類23份,發(fā)酵類12份,腌制類10份,飲品類3份,生鮮類6份,煮制類2份,燒烤類2份,速食類2份,辣椒面1份,奶片1份。將采集的樣品立即送入實驗室進行分離培養(yǎng)。采樣時間為2016年7月至11月。

1.2.2 克羅諾桿菌的培養(yǎng)純化與分離 所有樣品均在無菌條件下進行處理,按照《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 克羅諾桿菌屬(阪崎腸桿菌)檢驗》(GB 4789.40-2016)進行檢驗。對129份食物中的克羅諾桿菌進行分離。用接種環(huán)分別取各增菌培養(yǎng)物1環(huán),劃線接種到DFI瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)18～24 h,從DFI瓊脂平板上挑取疑似菌落,再次在DFI瓊脂平板上劃線純化,挑取單菌落并進行鑒定。

1.2.3 克羅諾桿菌16S rRNA測序鑒定 將純化后的菌株接種至TSB肉湯中,37 ℃培養(yǎng)16～18 h,用Tris-酚法[14]提取分離菌株的DNA,以克羅諾桿菌16S rRNA引物對其進行PCR擴增,引物序列為:16S-F-5′GCTYTGCTGACGAGTGGCGG 3′;16S-R-5′ATCTCTGCAGGATTCTCTGG 3′[15],擴增理論長度為929 bp。PCR反應體系:上下游引物各0.4 μL,DNA模板1 μL,2×TSINGKE Master Mix 10 μL,由去離子水補齊至20 μL。PCR反應條件:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性40 s,58.5 ℃退火50 s,72 ℃延伸40 s,35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。

1.2.4 克羅諾桿菌的生物被膜形成能力檢測 本研究采用兩種方法進行細菌生物被膜形成能力的檢測,其中試管法定性檢測,微孔板法定量檢測。

1.2.4.1 試管法 于5 mL TSB中接入50 μL新鮮菌液過夜培養(yǎng),37 ℃ 150 r/min隔夜培養(yǎng)。培養(yǎng)結束后,倒出菌液并用無菌水沖洗,去除管內雜質和菌體。隨后加入1.5 mL的1%結晶紫溶液,染色5 min,染色完畢后清水洗滌2～3 min,直到傾倒流出的水為無色,記錄試管壁的成膜情況[16]。

1.2.4.2 微孔板法 采用96孔板法,檢測從食品中分離的克羅諾桿菌生物被膜形成能力。將培養(yǎng)體系增加至200 μL/孔,培養(yǎng)時間延長至48 h。具體操作如下:在微孔板中,每孔加入180 μL 已滅菌的TSB培養(yǎng)基,再在每孔加入20 μL 18～24 h培養(yǎng)的新鮮菌液,37 ℃,培養(yǎng)48 h。待培養(yǎng)結束后,吸出菌液,每孔加入200 μL已滅菌的PBS(pH自然),輕輕吹打清洗,重復3次。加入200 μL甲醇,用于固定生物被膜(15 min)。棄去甲醇后,每孔加入200 μL的1%結晶紫溶液,染色5 min。染色結束后,清水沖洗微孔板至流水無色,徹底干燥后,每孔加入200 μL 33%的冰乙酸,并測定在630 nm處的OD值。每株樣品重復3次,200 μL TSB為空白對照組[16]。結果判定參考文獻[17]:把空白對照的平均值記為A值,設定空白對照A值加上其3倍標準差為臨界A值,即記為AC。根據樣品A值與AC之間的關系,對生物被膜形成能力的強弱等級進行以下4個分級:A≤AC屬于不附著(0),AC4AC 屬于強附著(+++)。

1.2.5 不同溫度對生物被膜形成能力影響測定 從中選取A/AC 值最大的2 株菌株,進一步探究不同溫度對其生物被膜形成能力影響[18]。具體操作如下:將A/AC值最大的兩株菌株接至96孔板,分別設置4、10和37 ℃溫度條件下培養(yǎng)48 h,進行生物被膜量判定并記錄數(shù)據。

1.2.6 克羅諾桿菌毒力基因的檢測 檢測ompX、cpa、hly和sip4種毒力基因,DNA模板、PCR反應體系同1.2.3,克羅諾桿菌毒力基因引物序列及退火溫度和片段擴增長度見表1。擴增產物采用瓊脂糖電泳和凝膠成像系統(tǒng)檢測。

表1 克羅諾桿菌的毒力基因引物Table 1 The primers of virulence genes for Cronobacter spp.

1.2.7 克羅諾桿菌藥敏檢測 采用18種抗生素對分離菌株進行藥敏檢測,陽性對照菌株為克羅諾桿菌ATCC 29544,根據美國臨床和實驗室標準協(xié)會(Clinical and laboratory standards institute,CLSI)推薦的K-B紙片擴散法進行操作,試驗結果按照CLSI 的標準進行操作和判定。

1.3 數(shù)據分析

2 結果與分析

2.1 菌株的分離結果

通過細菌的形態(tài)學特征初步得到43株克羅諾桿菌,進一步對疑似菌株進行16S rRNA序列比對,比對結果證實43株分離菌株均為克羅諾桿菌屬。129份食品樣品中克羅諾桿菌的檢出率為33.3%。其中,路邊攤采樣11份,檢出6份,檢出率為54.5%;菜市場采樣118份,檢出35份,檢出率為29.7%。樣品中,鹵制品27份,檢出12份,檢出率44.4%;米面類、發(fā)酵類與涼拌類食品檢出率則分別為34.7%、33.3%、27.5%。克羅諾桿菌的樣品分離來源詳見表2。

2.2 克羅諾桿菌生物被膜形成能力檢測結果

如表2，試管法定性檢測43株克羅諾桿菌生物被膜形成情況,發(fā)現(xiàn)43株分離菌株中有35株具有成膜能力,8株未成膜。微孔法定量檢測43株克羅諾桿菌生物被膜形成能力,根據樣品A值與臨界值AC之間的關系,43株分離菌株中,有4株被判定為無附著關系,即不具有生物被膜形成能力,而剩下39株則被判定為有附著關系。其中,有21株分離菌株為弱附著菌株,16株分離菌株為中等附著菌株,2株為強附著菌株,分離的克羅諾桿菌成膜率達到90.7%。

表2 克羅諾桿菌的樣品來源Table 2 The sampling sources of Cronobacter spp.

2.3 不同溫度對克羅諾桿菌分離菌株生物被膜形成能力影響

選取被膜強附著菌株Cro-16-13和Cro-16-32,分別在4、10和37 ℃條件下培養(yǎng)48 h。如圖1所示,4 ℃時,兩株克羅諾桿菌分離菌株幾乎無被膜形成;10 ℃時,兩株克羅諾桿菌被膜形成稍微增加,但不明顯;但隨著溫度升高到37 ℃條件下,兩株克羅諾菌株的被膜形成能力顯著高于AC臨界值。說明培養(yǎng)溫度對于細菌被膜形成有明顯影響。

圖1 不同溫度條件對克羅諾桿菌生物被膜形成能力影響Fig.1 Effects of temperature on Cronobacter spp.biofilm formation

2.4 克羅諾桿菌分離菌株毒力基因檢測結果

如表3，根據PCR檢測結果,ompX在43株克羅諾分離菌株中均有檢出,檢出率為100%;cpa檢出6株,檢出率為13.9%;hly檢出5株,檢出率為11.6%;sip未檢出。另外,每株菌至少攜帶一種毒力基因,其中,Cro-16-2、Cro-16-31、Cro-16-42和Cro-16-43菌株攜帶3個毒力基因,Cro-16-30、Cro-16-35、Cro-16-41菌株攜帶2個毒力基因。

表3 克羅諾桿菌毒力基因檢測結果Table 3 The results of virulence genes detection for Cronobacter spp.isolates

續(xù)表

2.5 克羅諾桿菌耐藥表型檢測結果

耐藥表型檢測結果表明(表4),43株克羅諾桿菌對苯唑西林、青霉素、克林霉素、桿菌肽B、萬古霉素5種抗生素耐藥率為100%;對利福平的耐藥率為97.7%;對紅霉素的耐藥率為7%,中介率為74.4%,敏感率為18.6%;對頭孢西丁、慶大霉素、阿米卡星、鏈霉素、四環(huán)素、亞胺培南、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、磺胺甲惡唑、氯霉素、呋喃妥因11種抗生素100%敏感。

表4 克羅諾桿菌分離菌株對18種藥物的敏感性檢測結果Table 4 The results of antimicrobial susceptibility test for Cornobacter spp.isolates

3 討論與結論

近年來克羅諾桿菌引起危害的報道逐年增加,其在不同食品中的檢出率也較高,如李遠宏等[19]從食品香辛料和調味樣品中分離克羅諾桿菌,檢出率為29.7%;陳萬義等[20]從生鮮蔬菜中分離克羅諾桿菌,檢出率為13%。黃啟紅等[2]從蔬菜、熟食和豆制品中分離發(fā)現(xiàn)克羅諾桿菌在這些食品的污染率達 35.9%。潘琢等[21]通采集某營養(yǎng)面條生產企業(yè)的生產原料、中間產品、環(huán)境、設備、人員和終產品等共101份樣品,發(fā)現(xiàn)生產過程中克羅諾桿菌檢出率為29.7%(30/101),終產品的克羅諾桿菌檢出率為50.0%。本研究從市場和路邊攤等共采集129份食品樣品,檢出43株克羅諾桿菌,檢出率為33.3%。與上述研究結果具有一致性。從我們的研究結果來看,鹵制類、米面類、發(fā)酵類及涼拌菜等熟食制品受克羅諾桿菌污染比較嚴重,說明食品在加工或售賣過程中易污染克羅諾桿菌。

本研究對克羅諾桿菌分離菌株的生物被膜附著情況進行檢測,發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)分離菌株具有形成生物被膜的能力。溫度對菌株的成膜能力影響較明顯,溫度升高,細菌的成膜量增加。杜玄等[18]認為克羅諾桿菌食品分離菌株具有較強形成細菌生物被膜的能力,并且不同培養(yǎng)條件對克羅諾桿菌生物被膜的形成影響不同。食品加工過程中常用的設備是由不銹鋼、鋁面板等表面具有微細溝槽和縫隙,容易滋生細菌并形成生物被膜[22]。因此,食品生產操作過程應采取措施控制細菌生物被膜的形成。

針對43株克羅諾桿菌分離菌株攜帶毒力基因的調查結果表明,ompX出現(xiàn)在所有43株分離菌株中,cpa和hly分別檢出6株和5株,sip未檢出。王倩寧[23]對陜西羊奶粉生產企業(yè)加工過程中分離的67株克羅諾桿菌的毒力基因cpa、hly、sip和ompX進行檢測,sip同樣未檢出,ompX檢出率100%,hly和cpa部分檢出,本文的研究結果與其他研究者有關結果一致。

本研究發(fā)現(xiàn)43株克羅諾桿菌對苯唑西林、青霉素、克林霉素、萬古霉素、桿菌肽B 5種抗生素耐藥率為100%,對利福平的耐藥耐藥率為97.7%,對頭孢西丁、慶大霉素、阿米卡星、鏈霉素、四環(huán)素、亞胺培南、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、磺胺甲惡唑、氯霉素、呋喃妥因11種抗生素100%敏感。黃玉蘭等[24]針對四川省市售嬰幼兒奶粉、嬰幼兒谷物輔助食品及臨床病例中分離的克羅諾桿菌藥物敏感性研究認為109株克羅諾桿菌對環(huán)丙沙星、萘啶酸、頭孢噻肟、慶大霉素、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑、氯霉素、四環(huán)素7種抗生素敏感,53株菌株對頭孢西丁耐藥。張翼等[25]從我國嬰幼兒食品中分離克羅諾桿菌,發(fā)現(xiàn)分離菌株對萬古霉素和四環(huán)素耐藥性較高,對氨芐西林、慶大霉素、奈替米星敏感。崔晶花等[26]對60株克羅諾桿菌耐藥檢測發(fā)現(xiàn)60株菌株均對青霉素G、苯唑西林、萬古霉素有耐藥性,對頭孢他啶、頭孢吡肟、亞胺培南、美羅陪南平、阿米卡星呈現(xiàn)高敏感性。該研究結果與其他研究者有關結果存在差異,可能是由于采樣來源不同。這些結果也表明克羅諾桿菌食品分離菌株對抗生素的耐藥情況在一定程度上反映了當?shù)乜股氐氖褂们闆r。

綜上,本研究為成都地區(qū)的克羅諾桿菌引起食物中毒的風險和防治提供參考。建議有關部門應加強市場上食品的抽檢,做好預防控制,保證消費者健康。