尹雪，梁晨，馮玥，張賀，王宇，李玉花

東北林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040

近年來，以環(huán)境友好型方式實(shí)現(xiàn)從廉價(jià)可再生的簡(jiǎn)單化合物催化合成高附加值的復(fù)雜化合物的代謝工程迅猛發(fā)展，在未來有望成為合成化學(xué)的替代品[1-5]。然而，與生物體內(nèi)的天然合成途徑相比，外源性合成途徑并不適用于合成各種各樣的目標(biāo)產(chǎn)物。在宿主自身代謝環(huán)境中，目標(biāo)產(chǎn)物的過度生產(chǎn)對(duì)其自身生存是很少有利或必需的[6]。隨著目標(biāo)合成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)日漸復(fù)雜，在構(gòu)建多基因的從頭合成途徑過程中，一些問題也隨之而來，例如，途徑代謝物被內(nèi)源性反應(yīng)轉(zhuǎn)移或通過分泌而喪失，中間產(chǎn)物的快速擴(kuò)散和降解或?qū)λ拗髯陨碛卸竞ψ饔茫孜锢寐实?，宿主代謝失衡影響自身生長(zhǎng)活力等，最終導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量降低[6]。為解決這些問題，研究人員模仿自然代謝控制機(jī)制，將途徑酶在空間上組織形成多酶復(fù)合體，通過將途徑酶共定位來提高途徑酶和代謝物的局部濃度，形成底物通道，從而提高途徑酶轉(zhuǎn)化效率，減少中間產(chǎn)物的積累，降低與宿主生物中其他組分的交叉反應(yīng)等[7]。

1985年Bulow等受到天然多功能蛋白的啟發(fā)，第一次嘗試將大腸桿菌Escherichia coli的β-半乳糖苷酶的3′端與半乳糖激酶的5′端融合表達(dá)，成功構(gòu)建了一個(gè)能催化由2個(gè)單獨(dú)酶催化完成的2個(gè)順序反應(yīng)的雙功能酶[8]。之后，該研究團(tuán)隊(duì)又將來自熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens的β-半乳糖激酶和半乳糖脫氫酶融合表達(dá)，將乳糖水解為半乳糖后，再將半乳糖氧化為乳酸，并且融合后的雙功能酶與游離酶相比，反應(yīng)效率提高了1.5–2.4倍[9]。該策略通過基因融合的方法將酶在空間上拉近，產(chǎn)生底物通道作用，實(shí)現(xiàn)催化效率的提高，已經(jīng)廣泛地應(yīng)用到其他研究中[10-13]。盡管多酶融合表達(dá)是一種極簡(jiǎn)單且高效的多酶組裝策略，但在實(shí)際應(yīng)用中仍然存在一些不確定因素和限制，例如，蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊或形成包涵體表達(dá)，導(dǎo)致酶催化活力降低甚至喪失等[14-16]。而且該策略不易應(yīng)用于兩個(gè)反應(yīng)以上的代謝途徑，并且由于融合蛋白的固定比例表達(dá)而不能平衡途徑酶的化學(xué)計(jì)量數(shù)。為了能使途徑酶化學(xué)計(jì)量達(dá)到平衡狀態(tài)，減少中間產(chǎn)物的積累，提高酶催化效率，合成生物學(xué)家采用更加模塊化的方法，使用合成生物支架的策略使途徑酶在空間上共定位，順序催化代謝反應(yīng)[17]。與融合蛋白策略不同的是，合成支架是利用不同相互作用結(jié)構(gòu)域或物理螯合的方式使途徑酶共定位的一個(gè)非催化亞單位，通過控制合成支架中結(jié)合結(jié)構(gòu)域的位置和比例對(duì)途徑酶的化學(xué)計(jì)量數(shù)進(jìn)行優(yōu)化平衡，能夠靈活地應(yīng)用于多個(gè)酶催化的代謝途徑[18]。

合成支架具有調(diào)節(jié)途徑酶達(dá)到最優(yōu)催化效率的巨大潛在優(yōu)勢(shì)，推動(dòng)了近些年生物學(xué)家對(duì)合成支架的開發(fā)利用。合成支架多是截取從自然界發(fā)現(xiàn)的具有相互作用的生物元件構(gòu)建而成，特別是基于蛋白質(zhì)的支架[19]。而近年來，隨著核酸納米技術(shù)的發(fā)展，研究人員除了蛋白支架外，還開發(fā)出利用核酸作為合成支架的策略[20-24]。本文基于合成支架的最新研究進(jìn)展，對(duì)其在合成生物學(xué)中解決代謝通量平衡發(fā)揮重要功能的原理進(jìn)行詳細(xì)闡述，并對(duì)其應(yīng)用前景作了初步探討。

1 蛋白支架

在生物進(jìn)化過程中，存在許多利用酶復(fù)合物提高代謝途徑通量的自然實(shí)例。色氨酸合酶就是其中具有代表性的例子，其由線性排列的4個(gè)亞基αββα組成，通過形成分子內(nèi)隧道，使中間產(chǎn)物直接從一個(gè)酶亞基的活性中心傳遞到下一個(gè)酶亞基的活性中心，減少中間產(chǎn)物的擴(kuò)散或被細(xì)胞內(nèi)其他組分降解，從而提高催化反應(yīng)速率，類似的酶還有氨甲酰磷酸合酶和谷氨酰胺磷酸核糖基焦磷酸酰胺基轉(zhuǎn)移酶[25-28]。而另一個(gè)典型的例子就是厭氧纖維素分解菌的天然纖維小體，由纖維素酶、半纖維素酶等水解酶以及蛋白支架構(gòu)成[29-30]。其中，蛋白支架是由包含重復(fù)序列的粘連蛋白(Cohesion) 組成的一個(gè)非催化亞單位，含有重復(fù)序列的錨定蛋白 (Dockerin) 與酶相連，通過cohesindockerin的相互作用將纖維素酶、半纖維素酶等水解酶固定實(shí)現(xiàn)多酶復(fù)合體的組裝，使多種水解酶與底物緊密接觸，提高底物局部濃度并確保酶的正確化學(xué)計(jì)量和順序，從而最大限度發(fā)揮酶的協(xié)同作用。因此，由蛋白支架組裝的多酶復(fù)合體的催化效率比游離的可溶性酶的催化效率高。

受到這種天然蛋白支架的啟發(fā)，研究人員構(gòu)建人工合成的蛋白支架來提高酶的催化效率[31-33]。蛋白支架是截取天然蛋白質(zhì)具有相互作用的結(jié)構(gòu)域 (即受體結(jié)構(gòu)域) 融合表達(dá)構(gòu)建而成，通過將相應(yīng)蛋白配體與途徑酶融合表達(dá)，利用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用將途徑酶固定在蛋白支架上，然后通過調(diào)節(jié)受體結(jié)構(gòu)域的比例和順序，平衡相關(guān)途徑酶的化學(xué)計(jì)量數(shù)，從而實(shí)現(xiàn)代謝途徑通量的增強(qiáng)。Tsai等利用特異的cohesin-dockerin相互作用在釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae細(xì)胞表面組裝外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了纖維素水解與乙醇生產(chǎn)相結(jié)合，乙醇的產(chǎn)量相對(duì)于通過游離酶混合物催化方式高出2.6倍以上[31](圖1)。類似的，在甲醇氧化脫氫生成二氧化碳的反應(yīng)過程中，利用蛋白支架將反應(yīng)過程中的3種NAD+依賴的脫氫酶組裝在酵母細(xì)胞表面，催化多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，形成底物通道，使NADH的產(chǎn)率提高了5倍[33]。

在硫磺礦硫化葉菌Sulfolobus solfataricus中發(fā)現(xiàn)的環(huán)狀的異源三聚體的細(xì)胞增殖核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA) 也被用作體外多酶組裝的蛋白支架，將假單孢氧還蛋白還原酶 (Putidaredoxin reductases，PdR)、假單孢氧還蛋白 (Putidaredoxin，PdX) 和細(xì)胞色素P450(Cytochrome P450，P450cam) 的N末端分別與PCNA的3個(gè)亞基的C末端融合，得到融合蛋白PCNA1-PdR、PCNA2-PdX和PCNA3-P450cam，在E.coli中表達(dá)純化后，利用PCNA 3個(gè)亞基間的相互作用通過體外混合的方式實(shí)現(xiàn)3個(gè)酶的組裝，產(chǎn)生更為有效的電子傳遞系統(tǒng)[34]。隨后，又通過結(jié)構(gòu)信息分析在PCNA亞基間特異地引入二硫鍵，使蛋白支架間的結(jié)合更為穩(wěn)定，相比于非共價(jià)鍵結(jié)合形成多酶復(fù)合物的方式使得P450cam反應(yīng)效率增強(qiáng)[35]。

除了上述用于體外反應(yīng)途徑的蛋白支架之外，體內(nèi)增強(qiáng)代謝通量應(yīng)用最多的人工蛋白支架是Dueber等截取后生動(dòng)物信號(hào)蛋白相互作用域融合表達(dá)構(gòu)建而成的蛋白支架 (GBD)x-(SH3)y-(PDZ)z[36](圖2A)。他們將甲羥戊酸途徑中的乙酰乙酰-輔酶A硫解酶 (Acetoacetyl-CoA thiolase，AACT)、羥甲基戊二酸-輔酶A合成酶 (Hydroxy-methylglutaryl-CoA synthase，HMGS)、羥基-甲基戊二酰-輔酶A還原酶 (Hydroxymethylglutaryl-CoA reductase，HMGR)分別與3種多肽GBD、SH3、PDZ的配體融合，然后將這3種融合蛋白與其可以特異性結(jié)合的蛋白支架在E.coli中共同表達(dá)。使用阻遏子平衡蛋白支架和酶的表達(dá)水平，通過調(diào)節(jié)蛋白支架的比例和順序?qū)γ傅幕瘜W(xué)計(jì)量數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，最終當(dāng)?shù)鞍字Ъ鼙壤齲∶y∶z為1∶2∶2時(shí)，甲羥戊酸的產(chǎn)量與無支架的酶催化相比提高77倍。該課題組還將此蛋白支架應(yīng)用于葡萄糖到葡萄糖酸的反應(yīng)途徑中，且當(dāng)?shù)鞍字Ъ鼙壤齲∶y∶z為1∶4∶4時(shí)，葡萄糖酸的產(chǎn)量提高5倍[37]。隨后，Agapakis等利用該支架使產(chǎn)氫氣反應(yīng)速率提高3倍[38]，Baek等[39]利用該支架共定位丁酸合成途徑中的酶，使丁酸產(chǎn)量提高3倍。并且，蛋白支架(GBD)x-(SH3)y-(PDZ)z還被成功地應(yīng)用于白藜蘆醇在真核生物S.cerevisiae的生物合成途徑中，通過對(duì)途徑酶進(jìn)行組裝，最終白藜蘆醇的產(chǎn)量與組裝前相比提高5倍，與融合蛋白策略相比提高2.7倍[40]。除此之外，研究人員還將單獨(dú)的支架蛋白及其配體分別與途徑酶融合表達(dá)，催化組裝2個(gè)酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，達(dá)到了提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量的目的[41-44]。盡管蛋白支架提高途徑代謝通量的確切機(jī)制尚不清楚，但據(jù)推測(cè)，由于酶的寡聚作用，使其可能形成大型復(fù)合物，類似于天然存在的代謝物微區(qū)，復(fù)合物中生成的中間體在擴(kuò)散之前就很快被復(fù)合物中的酶所消耗[17](圖2B)。蛋白支架 (GBD)x-(SH3)y-(PDZ)z的實(shí)際應(yīng)用不僅證明了其普遍適用性，還顯示出不同合成途徑優(yōu)化的最佳支架結(jié)構(gòu)比例會(huì)有所不同，這對(duì)如何合理設(shè)計(jì)具有預(yù)期功能的蛋白支架提出挑戰(zhàn)。

圖2 蛋白支架 (GBD)x-(SH3)y-(PDZ)z介導(dǎo)多酶組裝示意圖[17,36]Fig.2 Schematic diagram of protein scaffold (GBD)x-(SH3)y-(PDZ)z-mediated multi-enzyme assembly[17,36].(A) The synthetic scaffolds were constructed with three modular protein-protein interaction domains (GBD, SH3, and PDZ),which recruit three mevalonate biosynthetic enzymes (AACT, HMGS, and HMGR) C-terminally tagged with peptide ligands specific for these interaction domains[36].Local concentrations of intermediate and enzymes are elevated to improve reaction fluxes and balance kinetic parameters, in part by changing the number of repeats of these interaction domains (x, y, z) [36].(B) Enzymes with oligomeric structures could potentially bind multiple scaffolds, resulting in enzyme-scaffold complexes[17].

親和體 affibody分子由金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus蛋白A的免疫球蛋白結(jié)合區(qū)域衍化而來，含有58個(gè)氨基酸殘基，其相對(duì)分子質(zhì)量小、折疊速度快、特異性親和力很高，是一種類似于抗體的親和配體[45]。Tippmann等利用affibody分子來標(biāo)記途徑酶，抗獨(dú)特型affibody作為基礎(chǔ)來設(shè)計(jì)蛋白支架，利用affibody-抗獨(dú)特型與affibody間高特異性親和力結(jié)合使途徑酶共定位，提高反應(yīng)速率[46]。在S.cerevisiae體內(nèi)利用該蛋白支架體系共定位法尼基二磷酸合酶和法尼烯合酶，使法尼烯產(chǎn)量提高135%。通過對(duì)affibody分子的受體結(jié)合部位進(jìn)行隨機(jī)重組構(gòu)建噬菌體展示文庫(kù)，可以產(chǎn)生許多不同的高親和力的affibody分子，其能夠與相應(yīng)的蛋白質(zhì)分子 (即抗獨(dú)特型affibody) 特異性結(jié)合。因此，由affibody分子和抗獨(dú)特型affibody為基礎(chǔ)構(gòu)建的蛋白支架有望應(yīng)用于涉及更多酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)的代謝途徑。

應(yīng)用蛋白支架提高代謝通量，可以從以下幾個(gè)方面入手：1) 在支架配體與途徑酶融合表達(dá)時(shí)，二者之間需引入一段接頭序列 (Linker，即連接肽)，多選用柔性Linker (如 (GerSer)n)，降低支架配體與途徑酶之間的空間位阻，更有利于融合蛋白各個(gè)結(jié)構(gòu)域的正確折疊。2) 考慮到支架配體與途徑酶融合表達(dá)后，是否會(huì)對(duì)途徑酶的表達(dá)及活性造成影響，可以對(duì)其酶動(dòng)力參數(shù)進(jìn)行鑒定。3) 在構(gòu)建含有多個(gè)重復(fù)的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)的蛋白支架時(shí)，可以利用含有相同粘性末端的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行設(shè)計(jì)連接[47]。4) 將蛋白支架應(yīng)用于體內(nèi)代謝途徑時(shí)，除了對(duì)蛋白支架比例和位置進(jìn)行優(yōu)化，還可以采用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或阻遏子對(duì)途徑酶及蛋白支架的表達(dá)量進(jìn)行控制，從而減輕宿主的代謝負(fù)擔(dān)[36,40]。

2 核酸基支架

盡管合成蛋白支架在介導(dǎo)多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)、改善代謝通量等方面的研究取得了一定進(jìn)展，但隨著目標(biāo)代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)越來越復(fù)雜，途徑酶的種類及分子量的增加，導(dǎo)致含有多個(gè)重復(fù)的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白支架可能會(huì)難以表達(dá)。而近年來，隨著核酸納米技術(shù)的發(fā)展，核酸分子作為遺傳信息的載體，具有以下優(yōu)勢(shì)：1) 具有堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，并且有了一定深入的研究[48]。2) 通過雜交(DNA-DNA/DNA-RNA/RNA-RNA) 或鋅指蛋白(Zinc-finger protein，ZFP) DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或類轉(zhuǎn)錄激活因子 (Transcription activator-like effectors，TALEs) 的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，可以提供DNA/RNA-蛋白質(zhì)的相互作用。3) 核酸分子短鏈可折疊成各種結(jié)構(gòu)或組裝成二聚體或多聚體構(gòu)件[49]，從而可以合成各種具有特定的可編程的三維空間結(jié)構(gòu)[50-52]。4) 在納米級(jí)精度下核酸的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)可以用計(jì)算機(jī)模擬[53-55]，而一些計(jì)算機(jī)工具的開發(fā)也促進(jìn)了核酸納米結(jié)構(gòu)的合理設(shè)計(jì)[56-58]。所以，研究人員開發(fā)了基于核酸分子構(gòu)建合成支架，對(duì)途徑酶進(jìn)行組裝的新技術(shù)[59-60]。

2.1 DNA支架

DNA支架主要分為兩種類型，其一是用含有與DNA支架互補(bǔ)的特異核苷酸序列對(duì)途徑酶進(jìn)行化學(xué)修飾，然后利用堿基互補(bǔ)配對(duì)原則使途徑酶結(jié)合到DNA支架上，以提高酶促反應(yīng)速率，但這種類型的DNA支架只能應(yīng)用于體外反應(yīng)途徑；其二是將途徑酶與含有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，通過DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)⑼緩矫腹潭ㄔ贒NA支架上，實(shí)現(xiàn)途徑酶的共定位，其主要應(yīng)用于體內(nèi)代謝途徑。目前，已經(jīng)有許多成功的范例將DNA支架應(yīng)用于多酶體系的組裝。

2009年，Wilner等利用滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù) (Rolling circle amplification，RCA) 合成具有特異序列的單鏈DNA，并且用含有與特異序列互補(bǔ)的DNA寡核苷酸以共價(jià)連接的方式分別對(duì)葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase，GOx) 和辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP) 進(jìn)行化學(xué)修飾，體外利用堿基互補(bǔ)配對(duì)使GOx和HRP結(jié)合到單鏈DNA支架上，形成雙酶復(fù)合物激活級(jí)聯(lián)反應(yīng)，而在沒有DNA支架存在的情況下則不能激活雙酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)[61](圖3A)。這證明了DNA作為分子支架將酶有序組裝的可行性。然而，盡管此方法用于多酶組裝是可行的，但是單鏈DNA缺乏剛性可能導(dǎo)致支架的折疊，為了增加一維DNA支架的剛性，該研究團(tuán)隊(duì)還設(shè)計(jì)了二維DNA支架。預(yù)先設(shè)計(jì)一組具有部分互補(bǔ)序列的單鏈DNA形成六邊形結(jié)構(gòu)，其具有10 bp突出的特異DNA寡核苷酸序列，可以與帶有特異序列互補(bǔ)的DNA寡核苷酸序列修飾的GOx和HRP通過堿基互補(bǔ)配對(duì)，附著到兩個(gè)不同的六邊形上[62]。當(dāng)酶間距由4個(gè)六邊形 (~33 nm) 縮短為2個(gè)六邊形(~13 nm) 時(shí)，觀察到產(chǎn)物的量有顯著增加，研究表明這種酶催化效率的提高不僅是由于酶間距縮短使局部中間產(chǎn)物濃度升高而實(shí)現(xiàn)，還是由于中間產(chǎn)物在酶表面擴(kuò)散受限而導(dǎo)致，而二維-DNA折紙結(jié)構(gòu)也觀察到了相似的結(jié)果[22,62](圖3B)。隨后，F(xiàn)u等利用可編程的DNA納米結(jié)構(gòu)構(gòu)建了具有NAD+輔酶擺動(dòng)臂的DNA雙交聯(lián)拼貼支架，體外介導(dǎo)了6-磷酸葡萄糖脫氫酶 (Glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6pDH) 和蘋果酸脫氫酶 (Malicdehydrogenase，MDH) 的兩步脫氫級(jí)聯(lián)反應(yīng)[21](圖4)。通過利用DNA納米結(jié)構(gòu)的可編程性，可以對(duì)酶間距、位置及化學(xué)計(jì)量數(shù)進(jìn)行調(diào)節(jié)，來獲得最優(yōu)結(jié)果[63]。還有其他的大的超分子DNA支架和DNA折紙同樣可以用來介導(dǎo)多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，來加快其反應(yīng)速率[64-67]。但在體外將特異的寡聚核苷酸序列與途徑酶的賴氨酸殘基共價(jià)連接的化學(xué)修飾技術(shù)，成本較高并且會(huì)對(duì)酶的活性造成損壞，降低了這些策略的可行性與應(yīng)用的普遍性。

圖3 多維DNA支架結(jié)構(gòu)示意圖[61-62]Fig.3 Schematic diagram of multi-dimensional DNA scaffolds[61-62].(A) Linear one-dimensional single-stranded DNA scaffold synthesized using the rolling circle amplification (RCA).The two enzymes (GOx and HRP) were chemically conjugated with oligonucleotides to bind onto specific sites on the linear DNA scaffold[61].(B) Assembly of the GOx and HRP enzymes on the two-hexagon and four-hexagon two-dimensional DNA scaffolds through strands with partial complimentarity[62].

而如何將DNA支架的體外模型應(yīng)用于體內(nèi)環(huán)境又對(duì)研究人員提出了一項(xiàng)新的挑戰(zhàn)。對(duì)于體內(nèi)應(yīng)用來說，任何化學(xué)修飾的使用都不切實(shí)際。為避免化學(xué)修飾技術(shù)的使用，研究人員開始利用核酸結(jié)合蛋白與核苷酸序列特異性結(jié)合的特征實(shí)現(xiàn)對(duì)途徑酶的組裝。鋅指蛋白 (ZFP) 具有特異性識(shí)別核苷酸序列并與之特異結(jié)合的能力[68]，Conrado等將ZFP與質(zhì)粒DNA支架結(jié)合使用，實(shí)現(xiàn)了在E.coli體內(nèi)的合成代謝途徑的增強(qiáng)[69]。通過將相應(yīng)ZFP與途徑酶基因融合，然后在ZFP的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與質(zhì)粒DNA支架相應(yīng)鋅指結(jié)合位點(diǎn)的驅(qū)動(dòng)下，途徑酶就會(huì)結(jié)合到DNA支架的相應(yīng)位置上，從而介導(dǎo)多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)合成代謝途徑的增強(qiáng)。該支架的優(yōu)勢(shì)在于可以通過改變鋅指結(jié)合位點(diǎn)的間距、數(shù)量和順序?qū)ν緩矫傅慕M裝進(jìn)行優(yōu)化。質(zhì)粒DNA支架介導(dǎo)的合成代謝途徑具有更多的代謝物生成與普遍性應(yīng)用，使白藜蘆醇、1,2-丙二醇、甲羥戊酸的產(chǎn)量分別提高5倍、4.6倍、2.5倍[24](圖5)，L-蘇氨酸的生產(chǎn)時(shí)間縮短50%以上[69]。除此之外，ZFP與DNA支架的結(jié)合使用還可以介導(dǎo)纖維素水解轉(zhuǎn)化為其他化合物的反應(yīng)[70-71]。質(zhì)粒DNA支架具有可以容納多個(gè)互作基序和可變間距、無需考慮溶解性等問題的優(yōu)勢(shì)，但卻需要多個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域 (約90–120個(gè)氨基酸殘基) 對(duì)途徑酶進(jìn)行修飾，并且細(xì)胞內(nèi)DNA支架的最大濃度受到最大質(zhì)?？截悢?shù)的限制。

與ZFP相比，以類轉(zhuǎn)錄激活因子 (TALEs) 為基礎(chǔ)的DNA結(jié)合模塊具有更高的序列特異性，較低的非靶位點(diǎn)結(jié)合能力和細(xì)胞毒性，并且設(shè)計(jì)操作更簡(jiǎn)便。Zhu等利用TALE構(gòu)建了人工TALE-DNA支架，體內(nèi)將途徑酶與TALE基因融合，通過TALE的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與DNA支架特異性結(jié)合，形成多酶復(fù)合體，用于增強(qiáng)E.coli中異源合成吲哚乙酸 (Indole-3-acetic acid，IAA) 途徑[72]。TALE是植物致病菌黃單胞菌Xanthomonas的一類天然細(xì)菌效應(yīng)因子，與原核細(xì)胞具有實(shí)質(zhì)相容性，因此該支架更適用于整合到原核生物體內(nèi)。此外，TALE-DNA支架相較于其他支架體系還具有更高的穩(wěn)定性，不易被降解或與細(xì)胞內(nèi)其他組分發(fā)生相互作用。

圖4 輔酶擺動(dòng)臂-DNA雙交聯(lián)拼貼支架結(jié)構(gòu)示意圖[21]Fig.4 Schematic diagram of coenzyme swinging arm/DNA double-crossover tile scaffold[21].The NAD+-modified swinging arm is positioned halfway between two the dehydrogenases (G6pDH and MDH), facilitating the transfer of hydrides.

2.2 RNA支架

非編碼RNA (Non-coding RNA，ncRNA) 也同樣可以作為構(gòu)建合成支架的材料，其可以在細(xì)胞內(nèi)大量表達(dá)，且在細(xì)胞核外穩(wěn)定存在。但由于具有高度特異性結(jié)合親和力的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域較少，所以RNA支架很難采用與DNA支架相同的構(gòu)建策略。因此，研究人員選用RNA適配體作為途徑酶的結(jié)合位點(diǎn)，利用構(gòu)建順序?qū)ΨQRNA元件的策略在細(xì)胞內(nèi)建立RNA的等溫線組裝方法，構(gòu)建了基于具有二聚化和聚合結(jié)構(gòu)域的RNA的離散型、一維和二維RNA支架，并已經(jīng)用于體內(nèi)經(jīng)由[FeFe]-氫化酶和鐵氧還蛋白催化的產(chǎn)氫途徑的優(yōu)化[23](圖6)。通過將與RNA適配體靶蛋白融合的[FeFe]-氫化酶和鐵氧還蛋白招募到具有RNA適配體的離散型、一維和二維RNA支架上，使E.coli內(nèi)產(chǎn)氫量比無支架菌株有不同程度的增加，分別為4倍、11倍和48倍。這一結(jié)果顯示，隨著RNA支架維度的增加，其級(jí)聯(lián)反應(yīng)速率加快所產(chǎn)生的產(chǎn)物濃度呈指數(shù)級(jí)增加。

圖5 鋅指蛋白-質(zhì)粒DNA支架介導(dǎo)的大腸桿菌代謝途徑中的酶組裝[24]Fig.5 Zinc finger protein-plasmid DNA scaffold assisted assembly of metabolic pathways in E.coli[24].Schematic of different scaffold arrangements used for the two- or three-enzyme pathways producing resveratrol, 1,2-propanediol or mevalonate.E1, E2 and E3 are the biosynthetic pathway enzymes, a, b and c are Zinc finger domains, respectively.Scaffolds are plasmids with different zinc finger binding sites.

圖6 RNA支架介導(dǎo)的途徑酶的組裝[23]Fig.6 RNA scaffold-mediated pathway enzyme assembly[23].Pathway enzyme A and B scaffolded onto discrete, 1D,and 2D RNA assemblies.

同樣的RNA支架策略也被用來優(yōu)化在E.coli中異源表達(dá)?；?ACP還原酶 (Acyl-ACP reductase，AAR) 和醛去甲基化加氧酶 (Aldehyde deformylating oxygenase，ADO) 生產(chǎn)十五烷的代謝途徑[73]。與無支架菌株相比，二維RNA支架使十五烷產(chǎn)量提高2.4倍。研究人員發(fā)現(xiàn)，RNA適配體莖環(huán)長(zhǎng)度的改變會(huì)引起AAR與ADO活性位點(diǎn)空間方向的變化，從而影響代謝途徑的產(chǎn)量，說明了利用RNA支架使途徑酶共定位時(shí)，酶活性中心的相對(duì)空間取向也十分重要。迄今為止，使用體內(nèi)RNA支架策略優(yōu)化了更為復(fù)雜的4個(gè)酶催化的琥珀酸代謝途徑，使其代謝通量提高了88%，也進(jìn)一步說明了該支架的實(shí)用性。該支架相較于DNA支架來說，不僅可以優(yōu)化酶的化學(xué)計(jì)量數(shù)，控制途徑酶的間距和順序，還可以控制酶的空間方向[20]。而作為一種特異性識(shí)別分子，RNA適配體具有穩(wěn)定性高、靶目標(biāo)廣泛等優(yōu)點(diǎn)，由此構(gòu)建的RNA支架可以擴(kuò)展到更復(fù)雜的代謝途徑中使用。

3 總結(jié)與展望

在代謝工程領(lǐng)域，合成代謝途徑本質(zhì)上是多種來源的具有不同催化活性的酶整合在一起，獲得能高產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物的工程菌株。為此，研究人員采用多種優(yōu)化策略，如密碼子優(yōu)化[74]、啟動(dòng)子工程[75]、核糖體結(jié)合位點(diǎn)優(yōu)化[76]等，對(duì)代謝途徑中途徑酶的表達(dá)水平進(jìn)行優(yōu)化，并取得了一定的成功。合成支架策略作為補(bǔ)充或平行的方法，提供了模塊化且高度靈活的組裝工具，已經(jīng)在代謝途徑中廣泛應(yīng)用，通過翻譯后共定位途徑酶來調(diào)節(jié)其化學(xué)計(jì)量數(shù)、距離和空間取向，達(dá)到改善代謝通量的目的。表1總結(jié)了近年來在合成支架研究領(lǐng)域的主要研究進(jìn)展。

表1 不同類型合成支架的總結(jié)Table 1 A summary of the different synthetic scaffolds

雖然，合成支架策略在實(shí)際應(yīng)用過程中取得了一定進(jìn)展，但仍存在一些挑戰(zhàn)需要不斷地探索前進(jìn)，例如如何在確保酶活性不受影響的情況下精確地控制途徑酶的間距和排列，如何挖掘具有更高特異性的合成支架相關(guān)的生物學(xué)元件，以及如何實(shí)現(xiàn)該技術(shù)在工業(yè)上的廣泛應(yīng)用等。為克服這些挑戰(zhàn)，就必須更精確地了解合成支架的作用機(jī)制。合理設(shè)計(jì)具有組裝多酶功能的新型合成支架是一個(gè)復(fù)雜且涉及多學(xué)科的課題，其中包括生物物理、生物化學(xué)、計(jì)算生物學(xué)以及蛋白質(zhì)工程和核酸納米技術(shù)等。相信隨著合成生物學(xué)理論和技術(shù)的快速發(fā)展，在不久的將來會(huì)開發(fā)出更高效的工程工具，用來優(yōu)化天然產(chǎn)物合成代謝體系，從而實(shí)現(xiàn)復(fù)雜天然產(chǎn)物的工程化生產(chǎn)。