孫中貫，周波，王孟祺，王亞平，邢爽，郭學(xué)武，肖冬光

1 天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457

2 天津科技大學(xué) 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457

啤酒高濃高溫發(fā)酵是指采用較高濃度 (14 °P以上) 的麥芽汁在較高的溫度條件下進(jìn)行發(fā)酵，在啤酒成熟后過(guò)濾前，用經(jīng)處理的含飽和CO2的脫氧水將啤酒稀釋成常規(guī)濃度 (10–12 °P) 的技術(shù)[1-2]。高濃高溫發(fā)酵技術(shù)在不增加糖化、發(fā)酵等生產(chǎn)設(shè)備的基礎(chǔ)上，能夠大幅提高企業(yè)的生產(chǎn)效率，減少能源消耗，降低生產(chǎn)成本，獲得更高的經(jīng)濟(jì)效益。但是，高溫高濃發(fā)酵技術(shù)也會(huì)給啤酒發(fā)酵帶來(lái)一系列的問(wèn)題，如啤酒風(fēng)味不協(xié)調(diào)、泡沫穩(wěn)定性差、發(fā)酵結(jié)束后酵母絮凝性下降等[3-4]。

酵母菌絮凝是指酵母細(xì)胞之間相互聚集形成絮狀或顆粒狀細(xì)胞團(tuán)，并迅速沉降到發(fā)酵液底部的一種生理特性，絮凝的發(fā)生是一種無(wú)性的、鈣依賴(lài)的、可逆的過(guò)程[5]。絮凝的發(fā)生依賴(lài)于絮凝蛋白與鄰近細(xì)胞表面寡聚甘露糖鏈間的結(jié)合[6]，而工業(yè)酵母菌株絮凝特性的差異主要是由絮凝蛋白的濃度所決定的[7]。高濃度麥芽汁發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液中過(guò)量存在的甘露糖等糖類(lèi)物質(zhì)可抑制酵母菌株的絮凝性[8]。發(fā)酵溫度較低時(shí)，對(duì)酵母菌株絮凝性的影響較小，酵母細(xì)胞均具有較好的絮凝性[9-10]。有關(guān)學(xué)者認(rèn)為較低的發(fā)酵溫度下，酵母的新陳代謝速度減緩，進(jìn)而緩解了CO2對(duì)酵母菌株的擾動(dòng)作用，故溫度較低時(shí)酵母細(xì)胞趨于絮凝[11]；本課題組前期研究結(jié)果表明，麥芽汁濃度對(duì)工業(yè)啤酒酵母S6的絮凝性影響較顯著，而高溫發(fā)酵對(duì)S6菌株的絮凝性影響較小[12]。

Dietvorst 等研究發(fā)現(xiàn)在高濃度麥芽糖或葡萄糖的發(fā)酵條件下，與甲基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)的復(fù)合蛋白 (COMPASS) 能夠使FLO1、FLO5以及FLO9基因表達(dá)沉默，從而導(dǎo)致酵母菌株的絮凝能力下降[13]。酵母菌細(xì)胞壁上的絮凝蛋白表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性，其中FLO5基因編碼的絮凝蛋白與糖鏈的結(jié)合能力最強(qiáng)[14]。

啤酒中的高級(jí)醇是酵母在發(fā)酵過(guò)程中的主要副產(chǎn)物之一，是構(gòu)成啤酒風(fēng)味的重要物質(zhì)，適宜的高級(jí)醇含量能夠增加啤酒的醇厚感，但含量過(guò)高反而會(huì)造成酒體風(fēng)味物質(zhì)失衡，飲用后產(chǎn)生頭痛、口渴等癥狀[15-16]。研究表明較高的發(fā)酵溫度和麥芽汁濃度均有助于高級(jí)醇的生成[16-17]。酵母細(xì)胞內(nèi)高級(jí)醇的合成分為氨基酸分解代謝途徑(Ehrlich pathway) 和糖酵解合成代謝途徑(Harris pathway)[18]，如圖1所示。釀酒酵母菌株的BAT基因編碼的支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶催化支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨生成高級(jí)醇的前體物α-酮酸，因而B(niǎo)AT基因的缺失將有助于抑制高級(jí)醇的合成[19-20]。

目前有關(guān)利用代謝工程提高高濃高溫發(fā)酵條件下工業(yè)啤酒酵母絮凝性同時(shí)降低高級(jí)醇合成能力的研究還未有報(bào)道。本研究將在敲除BAT基因的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)FLO5基因的過(guò)量表達(dá)，以構(gòu)建高溫高濃發(fā)酵條件下高絮凝性、低高級(jí)醇合成能力的工業(yè)啤酒酵母優(yōu)質(zhì)菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

本研究所有菌株和質(zhì)粒均為作者所在實(shí)驗(yàn)室保存，詳見(jiàn)表1。重組菌株的構(gòu)建均采用單片段基因重組法[21]。

1.1.2 引物

實(shí)驗(yàn)中所用的引物列于表2。

1.1.3 培養(yǎng)基與試劑

LB 培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，氯化鈉10，酵母浸粉5，pH 7.0，115 ℃滅菌20 min。需要時(shí)使用前加入氨芐青霉素至100 μg/mL，固體培養(yǎng)基添加20 g瓊脂，用于大腸桿菌培養(yǎng)。

YEPD培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母浸粉10，自然pH，115 ℃滅菌20 min。制備平板時(shí)添加20 g瓊脂，用于酵母培養(yǎng)。篩選轉(zhuǎn)化子時(shí)需添加G418 至500 μg/mL。

YPG 半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基(g/L)：半乳糖20，蛋白胨20，酵母浸粉10，自然pH，115 ℃滅菌20 min。

麥芽汁培養(yǎng)基：采用二段式浸出糖化法。粉碎后的大麥芽，按1∶4的料水比于62 ℃糖化30 min，隨后升溫至70 ℃糖化至碘檢完畢，過(guò)濾煮沸后冷卻至室溫，離心去沉淀后，用自來(lái)水調(diào)整外觀糖度至18 °P，115 ℃滅菌20 min。

引物委托北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。高保真性DNA擴(kuò)增酶采用TransTaqHiFi，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。限制性?xún)?nèi)切酶、DNA 連接酶、去磷酸化酶購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。質(zhì)粒提取試劑盒和酵母菌總DNA提取試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司。硫酸鹽遺傳霉素 (G418)、氨芐青霉素、卡那霉素、博來(lái)霉素 (Zeocin) 購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。鮭魚(yú)精DNA購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

圖1 釀酒酵母高級(jí)醇合成代謝網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Biosynthetic pathways for higher alcohols formation in Saccharomyces cerevisiae.Black solid lines represent that the higher alcohols are derived from the Ehrlich pathway.Gray solid lines represent that the higher alcohols are derived from the Harris pathway.Black dotted lines represent the synthesis of corresponding carboxylic acids.

表1 本研究所用菌株及質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids in this study

1.2 啤酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

1.2.1 菌種活化

將甘油管中保存菌種轉(zhuǎn)接至YEPD斜面試管30 ℃活化培養(yǎng)2 d。

1.2.2 一級(jí)種子培養(yǎng)

取活化后的斜面菌種一環(huán)，接種于裝有5 mL 12 °P麥芽汁培養(yǎng)基的試管中，在28 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)24 h。

1.2.3 二級(jí)種子培養(yǎng)

一級(jí)種子液按10% (V/V) 的接種量接入裝有50 mL 12 °P麥芽汁培養(yǎng)基的150 mL三角瓶?jī)?nèi)，16 ℃靜置培養(yǎng)72 h。

1.2.4 啤酒發(fā)酵

二級(jí)種子液經(jīng)離心無(wú)菌水洗滌2次后得到的酵母泥，按0.5% (W/V) 的接種量接入盛有150 mL 18 °P麥芽汁培養(yǎng)基的250 mL三角瓶?jī)?nèi)，16 ℃下靜置發(fā)酵。

1.3 方法

1.3.1 目的片段的擴(kuò)增與質(zhì)粒構(gòu)建

以釀酒酵母S6菌株的基因組DNA為模板，利用引物對(duì)FLO5-U/FLO5-D、BA-U/BA-D、BB-U/BB-D、BA2-U/BA2-D、BB2-U/BB2-D、A1-U/A1-D、B1-U/B1-D擴(kuò)增FLO5基因、BAT2基因的2條上游同源序列BA和BA2、2條下游同源序列BB和BB2以及BAT1基因的上下游同源序列A1和B1。以質(zhì)粒pUG6為模板，K-U和K-D為引物對(duì)擴(kuò)增KanMX片段。

將目的基因FLO5經(jīng)XhoⅠ酶切處理并去磷酸化后，用In-fusion酶連接至相應(yīng)切口的質(zhì)粒Yep-PGK中，轉(zhuǎn)化驗(yàn)證后依次將經(jīng)BamHⅠ酶切并磷酸化后的KanMX片段，經(jīng)SmaⅠ酶切并磷酸化后的BA片段，經(jīng)SphⅠ酶切并磷酸化后的BB片段，連接到表達(dá)載體Yep-PGK相應(yīng)的位點(diǎn)上并進(jìn)行轉(zhuǎn)化驗(yàn)證，得到質(zhì)粒Yp-AFKB。

表2 用于基因擴(kuò)增的引物Table 2 Primers used for PCR

將經(jīng)SmaⅠ酶切并磷酸化后的BA2片段，經(jīng)SphⅠ酶切并磷酸化后的BB2片段，依次連接到含有KanMX片段的表達(dá)載體Yep-PGK相應(yīng)的位點(diǎn)上，轉(zhuǎn)化驗(yàn)證后得到質(zhì)粒Yp-A2FKB2。

將BAT1基因的上游同源序列A1片段用EcoRⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切，連接到相應(yīng)切口的質(zhì)粒pUC19中，轉(zhuǎn)化驗(yàn)證后再將質(zhì)粒用BamHⅠ和PstⅠ進(jìn)行雙酶切，與經(jīng)同樣酶切后的BAT1基因的下游同源序列B1片段連接，轉(zhuǎn)化驗(yàn)證后將KanMX基因片段用BamHⅠ進(jìn)行單酶切，連接到重組質(zhì)粒pUC19相應(yīng)的位點(diǎn)上，轉(zhuǎn)化驗(yàn)證后得到質(zhì)粒pUC-A1KB1。

以質(zhì)粒YP-AFKB為模板，BA-U和BB-D為引物對(duì)，PCR擴(kuò)增目的片段，經(jīng)純化回收、測(cè)序后，得到敲除BAT2基因一個(gè)等位基因同時(shí)過(guò)表達(dá)FLO5基因的重組片段BA+KanMX+PGKp+FLO5+PGKt+BB；以質(zhì)粒YP-A2FKB2為模板，BA2-U和BB2-D為引物對(duì)，PCR擴(kuò)增目的片段，經(jīng)純化回收、測(cè)序后，得到敲除BAT2基因的另一個(gè)等位基因同時(shí)過(guò)表達(dá)FLO5基因的重組片段BA2+KanMX+PGKp+FLO5+PGKt+BB2；以質(zhì)粒pUC-A1KB1為模板，A1-U和B1-D為引物對(duì)，PCR擴(kuò)增目的片段，經(jīng)純化回收、測(cè)序后，得到敲除BAT1基因一個(gè)等位基因的重組片段A1+KanMX+B1。

1.3.2 酵母的轉(zhuǎn)化和重組子的篩選

酵母的轉(zhuǎn)化采用LiAc/SS carrier DNA/PEG法[22]。利用G418篩選轉(zhuǎn)化子，提取轉(zhuǎn)化子基因組進(jìn)行PCR定點(diǎn)驗(yàn)證。

1.3.3 KanMX抗性基因的去除

采用Cre/loxP報(bào)告基因挽救系統(tǒng)[23]，剔除陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子中的篩選標(biāo)記基因KanMX。利用影印平板法篩選轉(zhuǎn)化子，以K-U/K-D為引物對(duì)進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

1.3.4 Real-Time qPCR測(cè)定基因轉(zhuǎn)錄水平

酵母RNA的提取及RNA的反轉(zhuǎn)錄均按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，使用SYBR?Premix ExTaqTMII(TaKaRa) 試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，通過(guò)2-ΔΔCt值法對(duì)目的基因及內(nèi)參基因ACT1進(jìn)行基因表達(dá)量的分析。

1.3.5 CO2排放量的測(cè)定

發(fā)酵前預(yù)先稱(chēng)量發(fā)酵體系總重，發(fā)酵過(guò)程中每隔12 h稱(chēng)重一次，稱(chēng)重前應(yīng)先搖晃三角瓶，以去除發(fā)酵液中的CO2，當(dāng)失重小于0.1 g時(shí)，表示發(fā)酵已經(jīng)結(jié)束。

1.3.6 酵母菌絮凝能力的測(cè)定

采用光密度改良法對(duì)酵母菌絮凝能力進(jìn)行測(cè)定[24]。

1.3.7 啤酒中高級(jí)醇含量的測(cè)定

啤酒發(fā)酵液經(jīng)蒸餾后得到的樣品使用氣相色譜法 (Agilent，USA) 測(cè)定。色譜條件為：色譜柱LAP-930，50 m×0.32 mm×1.0 μm；檢測(cè)器為氫火焰離子化檢測(cè)器。初始柱溫為50 ℃，保持8 min，以5 ℃/min的升溫速度升至200 ℃，保持5 min，進(jìn)樣量為1.0 μL，分流比為10∶1。

1.3.8 其他發(fā)酵參數(shù)的測(cè)定

利用手持糖度計(jì)測(cè)定原麥汁的表觀糖度；利用斐林試劑法測(cè)定發(fā)酵液中還原糖的含量；酒精度、發(fā)酵度及雙乙酰的測(cè)定依據(jù)啤酒分析方法進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組菌株S6-BF的構(gòu)建與性能分析

為了提高高溫高濃發(fā)酵條件下工業(yè)啤酒酵母S6 的絮凝能力，同時(shí)降低高級(jí)醇的生成量；選擇BAT2基因?yàn)橹亟M片段的整合位點(diǎn)，將重組片段BA+KanMX+PGKp+FLO5+PGKt+BB整合到出發(fā)菌株S6的基因組中。對(duì)在G418濃度為500 mg/L的YEPD平板上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證。轉(zhuǎn)化子的PCR驗(yàn)證結(jié)果表明，重組片段成功整合到酵母S6基因組中相應(yīng)的位點(diǎn)，將得到的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子命名為S6-BF (圖2)。

以出發(fā)菌株S6為對(duì)照菌株，分析重組菌株S6-BF、BAT2基因單敲除重組菌株S6-SB2及FLO5基因單過(guò)表達(dá)重組菌株S6-SF5的BAT2基因與FLO5基因轉(zhuǎn)錄水平、絮凝能力、高級(jí)醇合成能力以及發(fā)酵性能?；蜣D(zhuǎn)錄水平分析結(jié)果表明，F(xiàn)LO5基因在重組菌株S6-BF中的轉(zhuǎn)錄水平較出發(fā)菌株得到了非常顯著的提高，約為出發(fā)菌株的12倍；與重組菌株S6-SF5相比，F(xiàn)LO5基因在重組菌株S6-BF中的轉(zhuǎn)錄水平無(wú)顯著變化，表明BAT2基因的單敲除對(duì)FLO5基因的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有明顯的影響 (圖3A)；同時(shí)，絮凝能力分析結(jié)果顯示，重組菌株S6-SF5與S6-BF的絮凝能力均得到非常顯著的提升，是出發(fā)菌株S6絮凝能力的1.3倍 (圖3B)。與出發(fā)菌株相比，重組菌株S6-BF的BAT2基因轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，約為出發(fā)菌株的0.6倍，且FLO5基因的過(guò)量表達(dá)沒(méi)有對(duì)BAT2基因的轉(zhuǎn)錄水平產(chǎn)生影響 (圖3A)；在高級(jí)醇類(lèi)物質(zhì)中，僅有異戊醇的合成量得到非常顯著的降低，但降低量?jī)H有7.3%，其他高級(jí)醇的合成水平均沒(méi)有顯著的變化，同時(shí)重組菌株S6-BF絮凝能力的提高對(duì)高級(jí)醇的合成沒(méi)有產(chǎn)生影響 (圖3C)。由表3可知，BAT2基因的單敲除、FLO5基因的單過(guò)表達(dá)以及BAT2基因與FLO5基因的組合敲除過(guò)表達(dá)對(duì)菌株S6的發(fā)酵能力都沒(méi)有產(chǎn)生顯著的影響，因而可以通過(guò)再次降低BAT2基因表達(dá)量同時(shí)過(guò)量表達(dá)FLO5基因的方式，以期提高出發(fā)菌株S6的絮凝能力同時(shí)降低高級(jí)醇的合成水平。

圖2 重組菌株S6-BF的PCR驗(yàn)證Fig.2 The PCR verification of the mutant strain S6-BF.M: DL5000 DNA marker.(A) Primers: K-U and K-D.1:S6; 2: S6-BF.(B) 1–2: primers: B-U and K-D1; 1: S6; 2:S6-BF.3–4: primers: P-U and B-D; 3: S6; 4: S6-BF.

圖3 重組菌株S6-SB2、S6-SF5及S6-BF基因轉(zhuǎn)錄水平及性能分析Fig.3 Transcriptional levels and characteristics of S6-SB2, S6-SF5, S6-BF and parent S6.(A)Transcriptional levels of FLO5, BAT2 genes in mutants and the parental strain.(B) Flocculation ability of mutants and the parental strain.The flocculation ability was analyzed using the standard method.(C) The final levels of higher alcohols in mutants and the parental strain.Data are presented as the means of the results of three independent experiments.Error bars indicate standard deviations.Note: ** P<0.01, * P<0.05.

2.2 重組菌株S6-BF2的構(gòu)建與性能分析

以重組菌株S6-BF為出發(fā)菌株，構(gòu)建FLO5基因過(guò)量表達(dá)的重組菌株，需要再次利用KanMX抗性基因作為篩選標(biāo)記，因而必須剔除存在于重組菌株S6-BF基因組上的KanMX抗性基因。利用Cre/loxP報(bào)告基因挽救系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)KanMX抗性標(biāo)記的剔除和反復(fù)利用。

重組菌株S6-BF基因組中KanMX抗性基因剔除的PCR驗(yàn)證結(jié)果如圖4A所示，將得到的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子命名為S6-BFK。選擇重組菌株S6-BFK的BAT2基因?yàn)檎衔稽c(diǎn)，采用縮進(jìn)式基因整合的方式，即同源序列BA2位于同源序列BA的下游區(qū)域，同源序列BB2位于同源序列BB的上游區(qū)域，且同源序列彼此之間均無(wú)重復(fù)區(qū)域，將重組片段BA2+KanMX+PGKp+FLO5+PGKt+BB2整合到重組菌株S6-BFK的基因組中。對(duì)在G418濃度為500 mg/L的YEPD平板上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證。轉(zhuǎn)化子的PCR驗(yàn)證結(jié)果表明，重組片段成功整合到酵母S6基因組中相應(yīng)的位點(diǎn)，將得到的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子命名為S6-BF2 (圖4B)。

表3 原始菌株S6與重組菌株發(fā)酵能力分析Table 3 The fermentation performances of mutants and parent S6

圖4 重組菌株S6-BF2的PCR驗(yàn)證Fig.4 The PCR verification of the mutant strain S6-BF2.M: DL5000 DNA marker.(A) Primers: K-U and K-D.1: S6-BF; 2: S6-BFK.(B) Primers: K-U and K-D.1:S6-BFK; 2: S6-BF2.(C) Primers: B-U and K-D1.1:S6-BFK; 2: S6-BF2.(D) Primers: P-U and B-D.1:S6-BFK; 2: S6-BF2.

以原始菌株S6 為對(duì)照菌株，測(cè)定BAT2基因雙敲重組菌株S6-DB2、FLO5基因兩次過(guò)表達(dá)重組菌株S6-DF5以及重組菌株S6-BF2的BAT2基因與FLO5基因轉(zhuǎn)錄水平、絮凝能力、高級(jí)醇合成能力及發(fā)酵性能。FLO5基因在重組菌株S6-BF2中的轉(zhuǎn)錄水平得到了進(jìn)一步的提高，較原始菌株S6提高了17.8倍，與重組菌株S6-DF5中FLO5基因轉(zhuǎn)錄水平無(wú)顯著差異 (圖5A)；同時(shí)，重組菌株S6-BF2的絮凝能力與重組菌株S6-DF5的絮凝能力沒(méi)有明顯的差異，均較原始菌株S6提高了62.8%，絮凝能力達(dá)到了85.44% (圖5B)。同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明BAT2基因功能的缺失沒(méi)有對(duì)重組菌株的絮凝性產(chǎn)生顯著的影響。在重組菌株S6-DB2和S6-BF2中沒(méi)有檢測(cè)到BAT2基因的轉(zhuǎn)錄 (圖5A)，表明重組菌株S6-DB2和S6-BF2基因組上的BAT2基因已被全部破壞無(wú)法正常表達(dá)。重組菌株S6-BF2合成高級(jí)醇的能力也有顯著降低，其中異戊醇的合成量下降最為明顯；與原始菌株S6相比，重組菌株S6-BF2合成高級(jí)醇的能力降低了9.15%，與重組菌株S6-DB2的高級(jí)醇合成能力保持一致，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明重組菌株絮凝能力的提高沒(méi)有對(duì)高級(jí)醇的合成能力產(chǎn)生影響(圖5C)。由表3可知，重組菌株S6-BF2的發(fā)酵能力與原始菌株S6相比沒(méi)有顯著變化，表明FLO5基因的過(guò)量表達(dá)及BAT2基因功能的缺失沒(méi)有對(duì)工業(yè)釀酒酵母S6的發(fā)酵能力產(chǎn)生影響，同時(shí)也表明在BAT2基因和FLO5基因的改造過(guò)程中不存在相互協(xié)同或相互干擾的現(xiàn)象，且基因BAT2是釀酒酵母S6的非必需基因。

雖然重組菌株高級(jí)醇的合成能力下降較為顯著，但將高濃啤酒稀釋50%至常規(guī)濃度 (12 °P)后高級(jí)醇的含量仍然高于優(yōu)質(zhì)拉格啤酒所要求的高級(jí)醇含量的最適濃度[15]。釀酒酵母基因組中存在著B(niǎo)AT2基因的同源基因BAT1，而B(niǎo)AT1基因所編碼的蛋白同樣具有支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶的作用。以重組菌株S6-BF2為出發(fā)菌株敲除BAT1基因，考察BAT1基因的缺失對(duì)重組菌株高級(jí)醇合成能力的影響。

2.3 重組菌株S6-BF2B1的構(gòu)建與性能分析

以重組菌株S6-BF2為出發(fā)菌株實(shí)現(xiàn)對(duì)BAT1基因的敲除仍然需要以KanMX抗性基因?yàn)楹Y選標(biāo)記，因此在構(gòu)建菌株之前需要剔除重組菌株S6-BF2基因組中的KanMX抗性基因。試驗(yàn)方法及驗(yàn)證同重組菌株S6-BFK 的構(gòu)建過(guò)程，將剔除KanMX抗性基因的重組菌株命名為S6-BF2K。PCR驗(yàn)證結(jié)果如圖6A所示。將重組片段A1+KanMX+B1轉(zhuǎn)化至重組菌株S6-BF2K基因組中并進(jìn)行PCR驗(yàn)證，同時(shí)測(cè)定BAT1基因的轉(zhuǎn)錄水平、陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子及BAT1基因單敲除重組菌株S6-SB1的發(fā)酵性能、絮凝能力及高級(jí)醇合成水平。轉(zhuǎn)化子的PCR驗(yàn)證結(jié)果表明，重組片段A1+KanMX+B1已整合到重組菌株S6-BF2K基因組中相應(yīng)的位點(diǎn)，將得到的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子命名為S6-BF2B1 (圖6B)。

圖5 重組菌株S6-DB2、S6-DF5及S6-BF2基因轉(zhuǎn)錄水平及性能分析Fig.5 Transcriptional levels and characteristics of S6-DB2, S6-DF5, S6-BF2 and parent S6.(A)Transcriptional levels of FLO5, BAT2 genes in mutants and the parental strain.(B) Flocculation ability of mutants and the parental strain.The flocculation ability was analyzed using the standard method.(C) The final levels of higher alcohols in mutants and the parental strain.Data are presented as the means of the results of three independent experiments.Error bars indicate standard deviations.Note: ** P<0.01; * P<0.05.

圖6 重組菌株S6-BF2B1的PCR驗(yàn)證Fig.6 The PCR verification of the mutant strain S6-BF2B1.M: DL5000 DNA marker.(A) Primers: K-U and K-D.1: S6-BF2; 2: S6-BF2K.(B) 1–2: primers:A1-S and A1-X.1: S6-BF2K; 2: S6-BF2B1.3–4: primers:B1-S and B1-X.3: S6-BF2K; 4: S6-BF2B1.

基因轉(zhuǎn)錄水平分析結(jié)果表明，與原始菌株S6相比，重組菌株S6-BF2B1的BAT1基因轉(zhuǎn)錄水平下降顯著，是原始菌株BAT1基因轉(zhuǎn)錄水平的56.33%；重組菌株S6-BF2B1中FLO5、BAT2基因的轉(zhuǎn)錄水平與重組菌株S6-BF2相比沒(méi)有發(fā)生明顯的變化，且重組菌株S6-SB1中FLO5、BAT2基因的轉(zhuǎn)錄水平與原始菌株S6保持一致，證明BAT1基因的單次敲除沒(méi)有對(duì)FLO5、BAT2基因的轉(zhuǎn)錄水平造成任何影響 (圖7A)。酵母絮凝性分析試驗(yàn)結(jié)果顯示，重組菌株S6-BF2B1 的絮凝性是原始菌株絮凝性的1.62倍，這一水平與重組菌株S6-BF2 的絮凝能力相當(dāng)，同時(shí)BAT1基因的單敲除沒(méi)有對(duì)菌株S6的絮凝能力產(chǎn)生影響，表明BAT1基因的單敲除沒(méi)有影響菌株的絮凝能力(圖7B)。重組菌株S6-SB1、S6-BF2B1 的高級(jí)醇合成水平與原始菌株相比均有顯著降低，重組菌株S6-BF2B1 高級(jí)醇的合成量降低了19.05%，由原始菌株S6的175.58 mg/L下降至142.13 mg/L(圖7C)。將重組菌株S6-BF2B1高溫高濃發(fā)酵液稀釋50%至常規(guī)濃度 (12 °P) 時(shí)，高級(jí)醇含量與原始菌株S6在10 ℃發(fā)酵條件下的高級(jí)醇生成量基本相當(dāng)[12]。試驗(yàn)結(jié)果表明，BAT1基因功能的部分缺失有助于降低工業(yè)釀酒酵母S6的高級(jí)醇合成能力，且對(duì)出發(fā)菌株的發(fā)酵性能沒(méi)有產(chǎn)生顯著的影響 (表3)；獲得的重組菌株S6-BF2B1能夠在高溫高濃的釀造條件下有效提高釀酒酵母的絮凝性同時(shí)顯著降低高級(jí)醇的生成量。

2.4 重組菌株S6-BF2B1風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定

在高溫高濃的發(fā)酵條件下進(jìn)行啤酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，待主發(fā)酵結(jié)束后，對(duì)重組菌株S6-BF2B1及原始菌株S6代謝產(chǎn)生的主要風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如表4所示。

由表4可以看出，與原始菌株S6 相比，重組菌株S6-BF2B1 的高級(jí)醇合成能力及酯類(lèi)物質(zhì)的合成水平均有顯著的降低，醇酯比例由原始菌株S6的3.42上升至4.08，達(dá)到拉格啤酒要求的較為適宜的醇酯比例 (1∶4–1∶5)；雙乙酰的含量沒(méi)有發(fā)生較為顯著的變化。高級(jí)醇中異戊醇的含量降低最為明顯，從而導(dǎo)致乙酸異戊酯的含量顯著降低；此外，重組菌株S6-BF2B1合成乙酸乙酯的能力也明顯下降，這是否與BAT基因功能的減弱有關(guān)，還有待于進(jìn)一步的研究。由于本研究中的啤酒發(fā)酵是實(shí)驗(yàn)室錐形瓶小試發(fā)酵，只是完成了啤酒主發(fā)酵階段的實(shí)驗(yàn)沒(méi)有進(jìn)行后發(fā)酵和低溫貯藏，因而啤酒中雙乙酰的含量未能達(dá)到成熟啤酒的要求 (雙乙酰閾值范圍為0.10–0.15 mg/L)。

圖7 重組菌株S6-SB1、S6-BF2及S6-BF2B1基因轉(zhuǎn)錄水平及性能分析Fig.7 Transcriptional levels and characteristics of S6-SB1, S6-BF2, S6-BF2B1 and parent S6.(A)Transcriptional levels of FLO5, BAT2, BAT1 genes in mutants and the parental strain.(B) Flocculation ability of mutants and the parental strain.The flocculation ability was analyzed using the standard method.(C) The final levels of higher alcohols in mutants and the parental strain.Data are presented as the means of the results of three independent experiments.Error bars indicate standard deviations.Note: ** P<0.01; * P<0.05.

表4 重組菌株S6-BF2B1風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定Table 4 The flavor component profiles of mutant S6-BF2B1 and parent S6

3 討論

近年來(lái)在啤酒行業(yè)中興起的高溫高濃發(fā)酵技術(shù)為啤酒生產(chǎn)企業(yè)降低了生產(chǎn)成本，提高了經(jīng)濟(jì)效益，但同時(shí)也為生產(chǎn)企業(yè)帶來(lái)了一系列新的問(wèn)題。高溫高濃發(fā)酵導(dǎo)致的高滲透壓、高乙醇含量等問(wèn)題對(duì)酵母的生長(zhǎng)繁殖和發(fā)酵造成的影響是不可避免的，進(jìn)而會(huì)對(duì)啤酒的口感、風(fēng)味及酵母的絮凝性等方面帶來(lái)一些不良的影響。發(fā)酵結(jié)束時(shí)啤酒酵母能夠迅速地絮凝沉降，不但可以減少分離酵母所產(chǎn)生的能源消耗，也可以避免酵母長(zhǎng)時(shí)間懸浮于發(fā)酵液中發(fā)生自溶現(xiàn)象，而超過(guò)5%的酵母發(fā)生自溶，將對(duì)啤酒質(zhì)量造成難以挽回的影響[25]。針對(duì)高溫高濃發(fā)酵技術(shù)的研究，國(guó)內(nèi)學(xué)者多從啤酒的風(fēng)味物質(zhì)出發(fā)，而酵母絮凝性方面的研究相對(duì)缺乏[4,16]；國(guó)外學(xué)者的研究多集中在絮凝基因的調(diào)控機(jī)制方面，有關(guān)絮凝基因應(yīng)用方面的研究較少[13,26]。因此探索絮凝基因和高級(jí)醇代謝基因的協(xié)同改造是一條同時(shí)解決高溫高濃發(fā)酵條件下釀酒酵母絮凝性問(wèn)題和高級(jí)醇合成問(wèn)題的有效途徑。

本研究以工業(yè)啤酒酵母S6為研究對(duì)象，運(yùn)用基因同源重組的方式過(guò)量表達(dá)酵母絮凝性關(guān)鍵基因FLO5的同時(shí)，敲除參與高級(jí)醇合成代謝的BAT基因，最終獲得絮凝能力較強(qiáng)、高級(jí)醇合成水平適宜的工業(yè)啤酒酵母重組菌株S6-BF2B1。研究結(jié)果表明，重組菌株S6-BF2B1在高溫高濃的發(fā)酵條件下，不僅極大地增強(qiáng)了發(fā)酵結(jié)束后酵母菌株的絮凝能力，而且啤酒風(fēng)味物質(zhì)中高級(jí)醇的含量也得到了顯著的降低，達(dá)到了適宜的醇酯比例。實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)發(fā)酵結(jié)束后酵母菌株的沉降分離以及改善啤酒中的醇酯比例具有積極的意義，同時(shí)也表明BAT基因和FLO5基因在改造過(guò)程中不存在相互協(xié)同或相互干擾的現(xiàn)象。酵母細(xì)胞質(zhì)中編碼支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶的BAT2基因以及線粒體中編碼支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶的BAT1基因能夠?qū)⒅ф湴被徂D(zhuǎn)化為高級(jí)醇合成的重要前提物質(zhì)α-酮酸，因而具有促進(jìn)高級(jí)醇合成的作用；文中對(duì)BAT基因的敲除也達(dá)到了降低工業(yè)啤酒酵母S6高級(jí)醇合成水平的效果。

通過(guò)對(duì)FLO5基因、BAT2基因以及BAT1基因的遺傳改造增強(qiáng)了酵母細(xì)胞在高溫高濃發(fā)酵條件下的絮凝性同時(shí)降低了高級(jí)醇的合成水平，這為研究釀酒酵母的絮凝性和高級(jí)醇的代謝提供了一定的理論依據(jù)，同時(shí)對(duì)指導(dǎo)啤酒的高溫高濃發(fā)酵技術(shù)具有重要的實(shí)踐價(jià)值。