周偉，盧進(jìn)鵬，李亞平，楊林玉，胡小蕾，廖飛，楊曉蘭

1重慶醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院 臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016

2重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054

結(jié)核(Tuberculosis，TB)是由致病性結(jié)核分枝桿菌引起的全球流行病[1]。2016年約1 040萬人患結(jié)核，發(fā)病率高于艾滋病，是全球主要的公共衛(wèi)生問題[2]。現(xiàn)有結(jié)核治療策略面臨復(fù)發(fā)、藥物副作用和多藥耐藥的風(fēng)險(xiǎn)[3–5]；應(yīng)對(duì)結(jié)核，迫切需要新藥[6–7]。二氫葉酸還原酶 (Dihydrofolate reductase，DHFR)是細(xì)胞核酸代謝途徑關(guān)鍵酶，是腫瘤和細(xì)菌感染的治療靶標(biāo)[8–9]。結(jié)核分枝桿菌與人的DHFR氨基酸序列一致性僅為26%左右，基于此結(jié)構(gòu)差異有望設(shè)計(jì)結(jié)核分枝桿菌二氫葉酸還原酶(Mycobacterium tuberculosisDHFR，MtDHFR) 選擇性抑制劑[10]，使MtDHFR成為結(jié)核治療藥物的新靶點(diǎn)[11–12]?；诎械鞍装l(fā)現(xiàn)配體類藥物先導(dǎo)化合物主要依靠篩選配體庫。因此，建立適合篩選MtDHFR抑制劑庫的技術(shù)體系，對(duì)發(fā)現(xiàn)治療結(jié)核的化學(xué)新藥具有重要意義。

傳統(tǒng)方法篩選配體庫需制備純化合物庫再高通量篩選，庫制備成本高且效率低，篩選過程耗時(shí)且成本高。天然產(chǎn)物混合物和組合合成混合物作為配體庫價(jià)值很大，而且?guī)熘苽涑杀镜颓抑苽湫矢撸Y選此類混合物庫的技術(shù)難度巨大[13–15]。藥用MtDHFR抑制劑需要具有高親和力；目前篩選混合庫發(fā)現(xiàn)高親和力配體的方法，主要基于親和結(jié)合、靶蛋白配體復(fù)合物分離和LC-MS分析[16–18]，但也僅限于成分含量相差不大的混合物庫。天然產(chǎn)物混合物或組合合成混合物中有效成分含量未知或極低，如何發(fā)現(xiàn)極低含量的有效成分仍是技術(shù)挑戰(zhàn)[19]。本課題組建立了磁分離靶蛋白配體復(fù)合物后LC-MS分析篩選混合物組合庫的方法[20–21]；在此基礎(chǔ)上，優(yōu)化競爭結(jié)合反應(yīng)體系實(shí)現(xiàn)選擇性迭代富集，可快速發(fā)現(xiàn)混合物中極低含量的高親和力配體；LC-MS為成套的分析系統(tǒng)，靶蛋白大量活性表達(dá)、在磁珠表面固定化并保留其活性，就成為應(yīng)用此策略的關(guān)鍵。

此前發(fā)現(xiàn)，對(duì)帶6×His標(biāo)簽融合蛋白可用Ni2+-NTA磁珠位點(diǎn)選擇性固定化以期保留活性[22]，但固定化體系必需Ni2+等重金屬離子，而這些重金屬離子可能影響固定化酶的活性。羧基磁珠也是固定化蛋白的常用載體，此固定化體系基本不會(huì)有重金屬離子殘留干擾酶活性。本研究經(jīng)重組表達(dá)獲得MtDHFR，比較Ni2+-NTA磁珠和活化羧基磁珠固定化對(duì)MtDHFR活性、穩(wěn)定性及抑制劑響應(yīng)的影響，以探索適合磁分離篩選配體混合物庫的MtDHFR固定化方案。

1 材料與方法

1.1 試劑與器材

Ni2+-NTA磁珠 (批號(hào)20170714，100 g/L)、羧基磁珠 (Magnetic submicron particles carboxyl subtype F1，MSP-COOH-F1，批號(hào)20171121，120 g/L) 購自重慶博藍(lán)鷹生物技術(shù)有限公司；三乙醇胺 (Trolamine，TEA)、甲氨蝶呤 (Methotrexate，MTX)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(β-NADPH)、β-巰基乙醇購自Aladdin；六水合氯化鎳、硫酸鐵、異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)、硫酸卡那霉素、2-嗎啉乙磺酸 (4- Morpholineethanesulfonic acid，MES) 購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；4-羥乙基哌嗪乙磺酸 (4-(2-hydroxyerhyl)piperazine-1-erhaesulfonic acid，HEPES) 購自北京索萊寶科技有限公司；E.coliBL21 (DE3) 購自成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司；pET28a購自中美泰和生物技術(shù)有限公司；Ni2+-NTA層析柱購自南京金斯瑞生物科技有限公司；二氫葉酸(Dihydrofolic acid，DHF) 購自Sigma公司；N-羥基琥珀酸亞胺 (N-Hydroxysuccinimide，NHS)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(1-(3-Dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide，EDC) 購自東京化成工業(yè)株式會(huì)社，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。日本島津UV-2550紫外可見分光光度計(jì) (帶恒溫系統(tǒng))；其林貝爾QB-9001快速振蕩器；Promega 12孔磁分離架；Millipore 8050型超濾杯及再生纖維素超濾膜 (截留蛋白分子量>10 kDa)。

1.2 MtDHFR重組表達(dá)純化及表征

1.2.1 MtDHFR重組表達(dá)純化

含N端攜帶6×His標(biāo)簽的pET28a(+):dfrA表達(dá)質(zhì)粒[23]委托中美泰和生物技術(shù)有限公司合成。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coliBL21 (DE3)培養(yǎng)， 經(jīng)單克隆測序鑒定后，于含有100 mg/L卡那霉素LB液體培養(yǎng)基中，參照文獻(xiàn)[23]進(jìn)行6×His-MtDHFR表達(dá)和純化。用含50 mmol/L KCl的20 mmol/L磷酸鉀緩沖液 (pH 7.0)氮?dú)庹龎?0.15–0.20 Mpa) 超濾濃縮收集蛋白，Bradford法測蛋白濃度[24]，15% SDS-PAGE分析蛋白純度；所得酶蛋白溶液于-80 ℃保存。

1.2.2 MtDHFR的酶學(xué)性質(zhì)表征

MtDHFR活性測定：DHF用含10 mmol/L β-巰基乙醇的50 mmol/L磷酸鉀緩沖液 (pH 7.0)溶解至1.0 mmol/L溶液，β-NADPH用去離子水溶解至1.0 mmol/L溶液；反應(yīng)緩沖液為含50 mmol/L KCl的100 mmol/L HEPES (pH 7.0)[25]。MtDHFR用反應(yīng)緩沖液稀釋至40 mg/L。紫外分光光度計(jì)恒溫至25 ℃，反應(yīng)緩沖液調(diào)零，反應(yīng)總體積為1.0 mL，加終濃度均為50 μmol/L的β-NADPH和DHF，400 ngMtDHFR，混勻后延遲10 s用光度計(jì)連續(xù)監(jiān)測340 nm處3 min內(nèi)的消光變化；取消光變化線性范圍內(nèi)的速度 (ΔA/min) 作為初始反應(yīng)速度 (V)，按設(shè)定的底物消耗消光系數(shù) (ε=11 800 L/(mol·cm)[26]計(jì)算酶活力，1.0 min內(nèi)轉(zhuǎn)化1.0 μmol底物所需酶量為一個(gè)活力單位。

MtDHFR米氏常數(shù)：文獻(xiàn)報(bào)道β-NADPH對(duì)MtDHFR的米氏常數(shù)KmNADPH和DHF的米氏常數(shù)KmDHF均約4 μmol/L[27]。對(duì)于雙底物酶，使其中一個(gè)底物濃度大于10Km時(shí)改變另一底物濃度測定酶活，雙倒數(shù)分析確定表觀Km[28]。在1.0 mL含400 ng酶測定體系中，固定DHF終濃度為50 μmol/L，在2–10 μmol/L間改變?chǔ)?NADPH終濃度 (S)，測定初始反應(yīng)速度 (V)，回歸分析1/V對(duì)β-NADPH濃度倒數(shù)1/S響應(yīng)得KmNADPH；固定β-NADPH終濃度50 μmol/L，在 (0.5–10) μmol/L間改變DHF濃度，同法測定KmDHF。

MtDHFR熱穩(wěn)定性：室溫篩選配體操作過程不超過4 h[20–21]。用酶反應(yīng)緩沖液將MtDHFR稀釋到0.1 g/L，于25 ℃和0 ℃保存，不同時(shí)刻取MtDHFR溶液10 μL，25 ℃測定酶活分析其變化。

1.3 Ni2+-NTA磁珠固定MtDHFR及表征

1.3.1 Ni2+-NTA磁珠固定MtDHFR

取Ni2+-NTA磁珠懸液 (100 g/L)，磁力回收磁珠后用固定緩沖液 (pH 7.0，20 mmol/LTris-HCl) 洗3次并重懸為7.5 g/L。取不同濃度MtDHFR溶液40 μL預(yù)冷到0 ℃，200 r/min緩慢加入10 μL Ni2+-NTA磁珠 (約75 μg)，冰水浴中200 r/min振搖30 min；磁力分離取上清備測剩余蛋白，磁珠用固定緩沖液小心洗滌3次，每次200 μL，再重懸為3 g/L，于0 ℃保存待用。

1.3.2 Ni2+-NTA磁珠固定MtDHFR的容量及固定酶活性

用Bradford法測酶蛋白量[24]。固定時(shí)所用酶蛋白總量與上清酶蛋白量之差為固定化酶量。取飽和固載時(shí)單位量Ni2+-NTA磁珠固定酶量為固定化容量。用終點(diǎn)法測定固定化MtDHFR活性；在25 ℃恒溫的1.0 mL酶反應(yīng)體系中，加30 μg固定化MtDHFR的磁珠，反應(yīng)3 min后分離全部磁珠測定上清消光，以不加固定酶磁珠為對(duì)照計(jì)算消光之差及其變化速度 (ΔA/min)。

1.3.3 Ni2+、Fe3+及EDTA對(duì)MtDHFR活性的影響

將NiCl2、Fe2(SO4)3、EDTA用酶反應(yīng)緩沖液配成5 mmol/L溶液。在1.0 mL酶反應(yīng)緩沖液中，加不同終濃度的Ni2+、EDTA、Fe3+，分別與400 ngMtDHFR在冰上200 r/min作用不同時(shí)間；Ni2+與EDTA作用20 min后再加MtDHFR 400 ng冰上作用不同時(shí)間；然后恒溫25 ℃加底物測定酶活性。

1.4 羧基磁珠固定MtDHFR及表征

1.4.1 活化羧基固定MtDHFR

取MSP-COOH-F1懸液 (120 g/L)，用10 mmol/L MES緩沖液 (pH 6.0) 的洗3次并重懸至3 g/L。NHS和EDC分別用預(yù)冷10 mmol/L MES (pH 6.0)配成75 mmol/L、50 mmol/L溶液。取200 μL磁珠懸液 (約600 μg)，磁力分離去上清后加NHS和EDC各100 μL (摩爾比1.5∶1.0)[29]，或各50 μL再補(bǔ)充緩沖液至總體積200 μL，室溫200 r/min振搖反應(yīng)30 min后磁力回收磁珠，用預(yù)冷到0 ℃的固定緩沖液 (pH 7.0 的10 mmol/L MES) 洗3次并重懸至15 g/L，于0 ℃保存 (盡快使用)。在預(yù)冷到0 ℃含一定量MtDHFR的210 μL固定緩沖液中，分批加入預(yù)冷的活化羧基磁珠40 μL(600 μg)；在0 ℃固定反應(yīng)30 min，每隔3 min混勻一次。磁力回收磁珠，用酶反應(yīng)緩沖液洗滌并重懸至3 g/L，于0 ℃保存?zhèn)溆?。參照Ni2+-NTA磁珠固定化酶方法測定固定酶量。

1.4.2 光度法連續(xù)跟蹤磁珠固定酶反應(yīng)過程測定MtDHFR活性

于1.0 mL酶反應(yīng)體系中，分別在含底物50 μmol/L DHF、50 μmol/L β-NADPH的反應(yīng)緩沖液中加240 μg MSP-COOH-F1及1.0 μg酶，25 ℃下比較底物加磁珠前后340 nm消光值A(chǔ)340及其在酶作用下變化速度 (ΔA/min)，以消除磁珠對(duì)測定消光變化速度的影響。測定磁珠固定化酶活性時(shí)，在25 ℃的1.0 mL酶反應(yīng)體系中加75 μg固定酶磁珠，以10 s間隔連續(xù)監(jiān)測3 min內(nèi)340 nm處消光變化，并計(jì)算消光變化速度 (ΔA/min)及對(duì)應(yīng)酶活性。

1.4.3 羧基磁珠固定化 MtDHFR 和游離MtDHFR對(duì)MTX的響應(yīng)

于1.0 mL酶反應(yīng)體系中，加75 μg固定酶磁珠或0.5 μg游離酶，及不同終濃度MTX (1.0–10.0 nmol/L)，25 ℃混勻3 min后加底物測定酶活。用OriginPro 9.1擬合抑制率對(duì)MTX濃度對(duì)數(shù)響應(yīng)確定甲氨蝶呤對(duì)MtDHFR的IC50。

1.4.4 羧基磁珠固定MtDHFR儲(chǔ)存穩(wěn)定性

將固定酶磁珠 (3.0 g/L) 于25 ℃水浴和冰水浴0 ℃中靜置保存，于不同時(shí)刻取75 μg磁珠測定酶活性；分析活性隨保存時(shí)間的變化。

1.5 數(shù)據(jù)處理方法

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)偏差 (±s)；采用OriginPro 9.1進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 20.0，t檢驗(yàn)分析，P<0.05為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 MtDHFR表達(dá)和純化

6×His-MtDHFR誘導(dǎo)表達(dá)后，粗酶液經(jīng)Ni2+-NTA親和層析單次純化，蛋白收率約為12%，比活提高到15倍；超濾濃縮3次，蛋白收率約為30%，但比活提高近30%。純化總倍數(shù)約21倍 (表1)?？梢?，高純度MtDHFR易于獲得。SDS-PAGE顯示較純的目的蛋白條帶 (圖1)，分子量約為20 kDa，符合預(yù)期。

2.2 MtDHFR米氏常數(shù)及其受pH的影響

2.2.1 MtDHFR米氏常數(shù)

雙倒數(shù)分析得KmDHF為 (4.4±0.2) μmol/L (n=3)(圖2A)，KmNADPH為 (4.7±0.5) μmol/L (n=3) (圖2B)，都與文獻(xiàn)報(bào)道[27]接近。

2.2.2 pH對(duì)MtDHFR活性影響

在pH 4.0–8.0的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液中，MtDHFR活性隨pH增大而降低，到pH 8.0時(shí)幾乎無活性 (圖3)。MtDHFR活性在pH 7.0的100 mmol/LHEPES和pH 7.0的50 mmol/L磷酸鹽中無差異，故用pH 7.0的HEPES測定酶活性[25]。

圖1 SDS-PAGE檢測6×His-MtDHFR的純化Fig.1 SDS-PAGE analysis of 6×His-MtDHFR after purification by Ni2+-NTA.Lane 1: lysate; lane 2:supernatant; lane 3: sediment; lane 4: flow through fractions;lane 5: fractions eluted with 10 mmol/L imidazole; lane 6:fractions eluted with 20 mmol/L imidazole; lane 7: fractions of target eluted with 500 mmol/L imidazole; M: marker.

表1 MtDHFR表達(dá)純化效果 (±s, n=3)Table 1 Expression and purification of MtDHFR (±s, n=3)

表1 MtDHFR表達(dá)純化效果 (±s, n=3)Table 1 Expression and purification of MtDHFR (±s, n=3)

Purification steps Total protein (mg)Total activity (U)Specific activity (U/mg)Purified fold Recovery rate (%)Crude extract 135±12 30±1.5 0.2±0.1 Purification from Ni2+-NTA 16±1.2 50±4.0 3.1±0.2 15.5 12 Ultra-filtration 4.8±0.4 20±1.7 4.2±0.2 21.0 30

圖2 DHF (A) 和β-NADPH (B) 的表觀KmFig.2 Km of DHF (A) and β-NADPH (B).

2.3 Ni2+-NTA磁珠固定MtDHFR及其表征

2.3.1 Ni2+-NTA磁珠固定MtDHFR容量及保留活性

用75 μg Ni2+-NTA磁珠，隨MtDHFR用量增加，固定化酶量逐漸增加直至飽和 (圖4)，固定化容量為 (93±12) mg/g磁珠 (n=3)。固定化酶比活隨MtDHFR用量增加而緩慢增加至穩(wěn)定，但最大比活保留僅約為游離酶的32%。

圖3 MtDHFR活性的pH效應(yīng)Fig.3 pH effect on MtDHFR activity.

圖4 75 μg Ni2+-NTA磁珠基于6×His固定MtDHFR的固定化量和表觀比活保留比Fig.4 Immobilization capacity and residual activity percentage of 6×His-MtDHFR on Ni2+-NTA MSPs of 75 μg.

2.3.2 Ni2+、Fe3+及EDTA對(duì)酶活的影響

Ni2+在5–20 nmol/L之間對(duì)MtDHFR活性產(chǎn)生濃度和時(shí)間依賴性抑制，20 nmol/L Ni2+抑制大于50% (圖5A)。Fe3+對(duì)MtDHFR活性沒有明顯影響 (圖5B)。單獨(dú)EDTA對(duì)MtDHFR活性可抑制大于30%且依賴其濃度；Ni2+與MtDHFR作用前后加EDTA對(duì)MtDHFR活性抑制大于60%，有協(xié)同抑制效應(yīng) (圖5C)。Ni2+-NTA磁珠中含游離Ni2+，其可能降低固定酶活力且EDTA不能逆轉(zhuǎn)。

圖5 Ni2+(A)、Fe3+(B)、EDTA (C) 對(duì)酶活性的影響Fig.5 Effects of Ni2+, Fe3+and EDTA on MtDHFR activity.(A) Ni2+.(B) Fe3+.(C) EDTA alone and it plus Ni2+ in 100 mmol/L HEPES buffer at pH 7.0.

2.4 羧基磁珠固定MtDHFR及其表征

2.4.1 羧基磁珠對(duì)酶活測定的干擾

常規(guī)方法測定磁珠固定化酶活，需在固定化酶初速度反應(yīng)階段終止反應(yīng)并分離磁珠，再測定反應(yīng)液的吸收變化計(jì)算固定化酶活。由于反應(yīng)終點(diǎn)的確定易產(chǎn)生誤差并干擾反應(yīng)液吸收的測定，使固定化酶活測定重現(xiàn)性較低，故需考察不分離磁珠連續(xù)監(jiān)測反應(yīng)測定酶活的可行性。所用磁珠懸浮穩(wěn)定性好，其在有限時(shí)段內(nèi)對(duì)340 nm消光變化速度影響應(yīng)該很小。在1.0 mL酶反應(yīng)體系中，150 mg/L羧基磁珠、50 μmol/L β-NADPH和50 μmol/L DHF及其混合物，在340 nm的消光A340構(gòu)成恒定本底；在游離酶存在時(shí)，外加終濃度75、150、240 mg/L羧基磁珠，對(duì)光度法跟蹤酶反應(yīng)過程測定游離酶活性無影響。因此，磁珠對(duì)固定酶活測定無顯著干擾。本實(shí)驗(yàn)限制固定酶磁珠用量，用光度法連續(xù)跟蹤測定固定化酶活性。

2.4.2 羧基磁珠固定MtDHFR容量及保留活性

活化羧基磁珠約600 μg，MtDHFR用量在5–200 μg之間，固定化容量基本不變 (圖6)；最大固定化蛋白量約5.2 μg，對(duì)應(yīng)固定化容量為(8.6±0.6) mg/g磁珠 (n=3)。不分離磁珠，連續(xù)跟蹤固定化酶反應(yīng)過程并測定固定化酶活性，所得固定化酶表觀比活保留比例變化如圖6所示。在約600 μg活化羧基磁珠中，加入MtDHFR量從5–200 μg進(jìn)行固定時(shí)，磁珠固定化酶的表觀比活保留比例先增加后逐漸降低至穩(wěn)定，在酶用量10 μg時(shí)其表觀比活保留87%，而酶用量20–200 μg時(shí)磁珠固定化酶表觀比活保留比例穩(wěn)定在75%。為保留固定酶活性，選擇酶量∶磁珠量比為1∶60。

圖6 羧基磁珠固定酶活保留比例及固定化量對(duì)加入酶量的響應(yīng)Fig.6 Immobilized quantity and retention percentages of apparent specific activities in response to amounts of enzyme added for immobilization on MSP-COOH-F1.

2.4.3 游離和羧基磁珠固定MtDHFR的儲(chǔ)存穩(wěn)定性

游離和羧基磁珠固定化MtDHFR在反應(yīng)緩沖液0 ℃保存16 h活性均無顯著改變 (圖7)；游離MtDHFR在25 ℃下反應(yīng)緩沖液中保存2 h后活性持續(xù)降低，4 h下降超過10%，16 h降低近60%；固定化酶25 ℃保存4 h活力僅下降4%，16 h下降僅35%。在混合物庫篩選中，從配體競爭結(jié)合固定化酶到磁分離洗滌的全流程，操作時(shí)間不超過4 h，故此固定化MtDHFR穩(wěn)定性滿足混合物篩選要求。

圖7 游離酶和羧基磁珠固定MtDHFR的穩(wěn)定性Fig.7 Stability of the free and MSP-COOH-F1 immobilized MtDHFR.

2.4.4 MtDHFR羧基磁珠固定前后對(duì)MTX的IC50

MtDHFR在羧基磁珠上固定前后對(duì)MTX的IC50無顯著差異 (P>0.05) (圖8)，且都與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果接近[25,27]?？梢?，用MSP-COOH-F1固定化MtDHFR適合篩選其高親和力抑制劑。

3 討論

本研究構(gòu)建N端帶6×His標(biāo)簽的MtDHFR表達(dá)載體pET28a，在E.coliBL21 (DE3) 中成功重組表達(dá)并純化。比較發(fā)現(xiàn)，不同磁珠固定化重組MtDHFR有顯著差異。6×His-MtDHFR通過其6×His標(biāo)簽與Ni2+-NTA磁珠螯合，屬于位點(diǎn)選擇性固定化，但不適合用于磁分離篩選MtDHFR的高親和力配體。首先，Ni2+-NTA磁珠固定化酶保留活性很低。其次，Ni2+-NTA鰲合帶6×His標(biāo)簽酶復(fù)合物穩(wěn)定性對(duì)pH敏感，在pH 8.0及以上鰲合酶才能維持固定化狀態(tài)。但是，6×His-MtDHFR在pH 8.0時(shí)保留的活性很低而不適合篩選其抑制劑。相反，MtDHFR氨基酸序列僅有1個(gè)賴氨酸(Lys-53) 及N端伯氨基，三維結(jié)構(gòu) (PDB code:4KNE) 中，此賴氨酸及其N端伯氨基都遠(yuǎn)離活性位點(diǎn)[23]，可通過伯氨基與磁珠表面羧基生成酰胺固定化；這種固定化實(shí)際上也屬于位點(diǎn)選擇性固定化。MSP-COOH-F1表面為兼性離子對(duì)修飾層并帶長連接臂的羧基適合固定蛋白，而磁珠對(duì)疏水小分子的非特異吸附弱。優(yōu)化條件后，此羧基磁珠固定MtDHFR達(dá)到 (8.6±0.6) mg/g磁珠，特別是固定化酶保留 (87±4)%活性，固定前后其對(duì)MTX的IC50無顯著差異，而固定化酶在4 h內(nèi)穩(wěn)定。所以，用此羧基磁珠固定化MtDHFR有望用于配體混合物庫中高親和力配體的選擇性富集與篩選。

圖8 MTX對(duì)游離酶和羧基磁珠固定MtDHFR的IC50Fig.8 IC50 of MTX against free and MSP-COOH-F1 immobilized MtDHFR.

用MSP-COOH-F1羧基磁珠固定化MtDHFR時(shí)，磁珠表面羧基活化程度不宜太高，對(duì)設(shè)定量磁珠存在最優(yōu)酶蛋白用量。可能磁珠固定蛋白量少而使位阻小，有利于固定化酶結(jié)合底物。對(duì)MSPCOOH-F1，酶蛋白量對(duì)磁珠量比例接近1∶60，有利于獲得高保留活性固定化酶。MSP-COOH-F1羧基固定化MtDHFR后懸浮穩(wěn)定性好，光度法連續(xù)監(jiān)測反應(yīng)混合物消光 (考慮磁珠對(duì)光的散射故稱為消光) 適合測定酶活性。

總體而言，6×His-MtDHFR適合在大腸桿菌大量表達(dá)，通過成酰胺鍵固定在MSP-COOH-F1上適用于磁分離篩選其抑制劑混合物庫。后續(xù)工作正在進(jìn)行中。