勾靜嫻， 姜相君， 曲海霞， 崔艷欣

青島市市立醫(yī)院消化內(nèi)二科 山東 青島 266071

補(bǔ)體C1q/腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白6(complement C1q/tumor necrosis factor-related protein 6，CTRP6)發(fā)現(xiàn)于2010年，是近年來發(fā)現(xiàn)的與脂聯(lián)素同源的CTRP家族成員之一，是一種含有240個(gè)氨基酸的糖蛋白,分子量為29 kDa，其結(jié)構(gòu)與其他CTRP家族成員(除CTRP4外)的結(jié)構(gòu)基本相同，均由4個(gè)不同結(jié)構(gòu)域組成，包括氨基端的信號肽、短的可變結(jié)構(gòu)域、膠原樣可重復(fù)的結(jié)構(gòu)域和羧基末端類似補(bǔ)體C1q的球狀結(jié)構(gòu)域[1]。CTRP6在哺乳動(dòng)物中表達(dá)廣泛，如脂肪組織、心臟、胎盤、大腦、滑膜組織等均有表達(dá)[1-3]，并在不同組織中發(fā)揮不同的代謝作用。相關(guān)研究[1, 4-6]表明，CTRP6參與脂肪代謝及糖代謝，使其可能成為肥胖和糖尿病等代謝綜合征的一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。CTRP6還顯著增加巨噬細(xì)胞中抗炎因子白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)的表達(dá)[2]。另外，CTRP6能夠改善心肌梗死后心臟功能和改善心室重構(gòu)[7]。近年來，CTRP6被發(fā)現(xiàn)與自身免疫性疾病相關(guān)，包括1型糖尿病、白癜風(fēng)、Graves病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[3, 8-12]。

結(jié)腸癌好發(fā)部位為乙狀結(jié)腸與直腸交界處，目前仍是我國甚至世界發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤之一，發(fā)病率排所有惡性腫瘤第4位，死亡率為第5位，近20多年來，世界上多數(shù)國家的發(fā)病率呈上升趨勢，我國也十分明顯。以40～50歲年齡組發(fā)病率最高，發(fā)病率男性高于女性[13]。治療的關(guān)鍵在于早發(fā)現(xiàn)、早診斷，以利于手術(shù)根治，其預(yù)后也取決于早期診斷與手術(shù)能否根治及有無復(fù)發(fā)。

本研究通過檢測結(jié)腸癌患者癌組織中CTRP6的表達(dá)情況及其與腫瘤大小、病理分型、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管內(nèi)瘤栓、神經(jīng)侵犯等相關(guān)性，分析CTRP6在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展中可能的作用，為進(jìn)一步研究其在診斷、治療方面的作用設(shè)想提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1研究對象隨機(jī)選取2016年1月至2016年12月在青島市市立醫(yī)院普外科手術(shù)且經(jīng)病理確診為結(jié)腸癌的病例共121例臘塊標(biāo)本進(jìn)行研究。所有患者在術(shù)前未經(jīng)任何針對癌癥的治療。由2名病理科醫(yī)師作出病理診斷，診斷結(jié)果包括：病灶大小、大體分型、浸潤深度、組織學(xué)分級、脈管內(nèi)瘤栓、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。分級診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《阿克曼外科病理學(xué)》[14]。121例標(biāo)本中男78例，女43例，年齡39～89歲，中位年齡66.2歲；組織學(xué)分級低分化31例，中分化89例，高分化1例；腫瘤直徑≥5 cm者54例，3 cm≤腫瘤直徑<5 cm 51例，<3 cm 16例。腫瘤浸潤深度：黏膜下層3例、肌層15例、漿膜層103例；轉(zhuǎn)移情況：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：陽性51例，陰性70例；脈管內(nèi)瘤栓：陽性49例，陰性72例；神經(jīng)侵犯：陽性34例，陰性87例。本研究獲得了醫(yī)院倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)，入選本研究的結(jié)腸癌患者或家屬均簽署知情同意書，同意使用其組織標(biāo)本用于本項(xiàng)科學(xué)研究。

1.2主要儀器設(shè)備及試劑主要試劑及來源：兔抗人CTRP-6多克隆抗體(bs-14104R)(北京博奧森公司產(chǎn)品)；PV 9000免疫組化試劑盒(PV-9000)(中杉金橋公司產(chǎn)品)；DAB顯色試劑盒(DAB-1031)(福州邁新公司產(chǎn)品)；EDTA抗原修復(fù)緩沖液 (MVS-0080) (福州邁新公司產(chǎn)品)。

主要儀器及來源： 組織芯片儀(Beecher Instruments，美國)；低溫冰箱(海爾公司，青島)3.1～1 000 μl加樣器(雷勃分析儀器有限公司，上海)；AS325輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(SHANDON公司，英國)；可控式恒溫干燥箱(湖北省黃石市醫(yī)療器械廠)；電熱恒溫水浴箱(北京醫(yī)療設(shè)備廠)；AEG-120電子天平(SHIMADZU公司，日本)；半自動(dòng)組織包埋機(jī)(SHANDON公司，英國)；全自動(dòng)真空脫水機(jī)(SHANDON公司，英國)；BX-50電光源多頭顯微鏡(OLYMPUS公司，日本)；BX-50全自動(dòng)顯微照相系統(tǒng)(OLYMPUS公司，日本)。

1.3方法

1.3.1 免疫組化操作步驟：(1)脫蠟和水化；(2)抗原修復(fù)，EDTA緩沖液修復(fù)90 s；(3)阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；(4)根據(jù)組織大小，滴加50 μl一抗，37 ℃孵育；PBS緩沖液沖洗；(5)滴加反應(yīng)增強(qiáng)液100 μl，室溫孵育；然后PBS緩沖液進(jìn)行沖洗；(6)滴加兔抗人CTRP-6多克隆抗體(bs-14104R)，室溫孵育；PBS緩沖液再次沖洗；(7)DAB顯色，室溫孵育，顯微鏡下觀察顏色的發(fā)展情況，自行掌握染色時(shí)間；(8)復(fù)染；(9)脫水、透明、封片。

1.3.2 結(jié)果判定：在200倍和400倍高倍鏡視野下對比觀察同一切片的癌細(xì)胞胞漿和正常非癌細(xì)胞胞漿的著色情況，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞胞漿內(nèi)黃色顆粒狀信號，按染色程度(0分：陰性著色，1分：淡黃色，2分：淺褐色，3分：深褐色)判分，2～3分判定為陽性結(jié)果，0～1分判定為陰性結(jié)果。分別記錄癌細(xì)胞和正常非癌細(xì)胞的著色情況。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用非參數(shù)Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1癌組織及癌旁組織中CTRP6的表達(dá)121例結(jié)腸癌患者中，108例患者癌細(xì)胞胞漿中的CTRP6表達(dá)陽性，13例患者癌細(xì)胞胞漿中的CTRP6表達(dá)陰性，所有結(jié)腸癌患者的正常非癌細(xì)胞中的CTRP6表達(dá)均為陰性，典型圖片如圖1～4所示。提示在結(jié)腸癌癌細(xì)胞中CTRP6顯著高表達(dá)(P<0.05)，在正常非癌細(xì)胞中幾乎不表達(dá)。

圖1～2 癌細(xì)胞胞漿內(nèi)見褐色顆粒狀陽性信號(紅色箭頭)；正常非癌細(xì)胞胞漿內(nèi)不著色或著色弱(藍(lán)色箭頭)(200×)；圖3～4 癌細(xì)胞胞漿內(nèi)見褐色顆粒狀陽性信號(紅色箭頭)；正常非癌細(xì)胞胞漿內(nèi)不著色或著色弱(藍(lán)色箭頭)(400×)Fig 1-2 Brownish-granular positive signal was seen in the cytoplasm of cancer cells (red arrow); normal non-cancer cells were not stained or weakly stained within the cytoplasm (blue arrow) (200×); Fig 3-4 Brownish-granular positive signal was seen in the cytoplasm of cancer cells (red arrow); normal non-cancer cells were not stained or weakly stained within the cytoplasm (blue arrow) (400×)

2.2CTRP6的表達(dá)情況與患者臨床病理特征之間的相關(guān)性CTRP6在結(jié)腸癌的表達(dá)與患者性別、平均年齡、腫瘤大小、分化程度、浸潤深度、脈管內(nèi)瘤栓、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無相關(guān)性(P均>0.05,見表1)。

表1 CTRP6的表達(dá)情況與結(jié)腸癌患者病理特征的關(guān)系Tab 1 Relationship between CTRP6 expression and pathological features of colon cancer patients

3 討論

結(jié)腸癌是重要的消化道惡性腫瘤之一，其病死率高，給患者及其家庭帶來了極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)及心理壓力。究其原因，為其早期診斷及治療的手段不足。結(jié)腸癌的危險(xiǎn)因素復(fù)雜多樣，但其發(fā)生、發(fā)展機(jī)制并不十分明確，仍是目前需要攻克的難題。

炎性因素被認(rèn)為與結(jié)腸癌的發(fā)展有關(guān)，多個(gè)研究[15-16]表明，多種炎癥介質(zhì)參與調(diào)控結(jié)腸癌的發(fā)展、轉(zhuǎn)移等，如IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、IL-10。在一項(xiàng)丹麥人群的研究[15]中發(fā)現(xiàn)，IL-10和膳食纖維之間在結(jié)腸癌發(fā)生中的相互作用，高膳食纖維攝入量似乎可以降低具有結(jié)腸癌的遺傳易感性個(gè)體患結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)。過表達(dá)CTRP6能降低致炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá),增加抗炎因子IL-10的表達(dá)[7]，CTRP6通過激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(ERK1/2)通路而誘導(dǎo)IL-10在巨噬細(xì)胞的表達(dá)[2]。另有研究[5]表明，gCTRP6在肌肉組織中激活A(yù)MP依賴的蛋白激酶(adenosine 5’monophosphate-activated protein kinase, AMPK)通路呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性，AMPK信號通路能強(qiáng)有力地調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞對炎癥的反應(yīng)，增加抗炎因子IL-10的表達(dá)[17]，但CTRP6是否能調(diào)節(jié)促炎性反應(yīng)信號通路目前未知，仍需要進(jìn)一步研究。另一項(xiàng)在卵巢癌的研究[18]中發(fā)現(xiàn)，卵巢癌患者相較于正常健康志愿者，血清中CTRP6水平明顯降低，并且在培養(yǎng)基中的細(xì)胞液的CTRP6檢測得到了相同的結(jié)果。在進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的增殖性和侵襲性檢測中發(fā)現(xiàn)，CTRP6的水平下降會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的侵襲力加強(qiáng)，當(dāng)重新加以CTRP6處理時(shí)，腫瘤細(xì)胞的增殖力受到抑制。研究還發(fā)現(xiàn)，檢測出IL-8的分泌水平與CTRP6相反，且呈劑量依賴性。推測CTRP6可能通過抑制IL-8和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)通路參與抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[18]。CTRP6能否通過調(diào)節(jié)炎癥因子這一通路來參與結(jié)腸癌的發(fā)展調(diào)控則需要進(jìn)一步證實(shí)。

在肝癌的研究中，在未發(fā)生癌變的肝組織中并未檢測到CTRP6，但能在21/30的肝細(xì)胞癌組織標(biāo)本中檢測出。這表明，CTRP6并非均勻分布,而是局限分布于肝癌細(xì)胞[19]。這個(gè)結(jié)果與我們研究CTRP6在結(jié)腸癌的表達(dá)分布類似：108例結(jié)腸癌患者癌細(xì)胞胞漿中的CTRP6表達(dá)陽性，13例患者癌細(xì)胞胞漿中的CTRP6表達(dá)陰性，所有121例結(jié)腸癌患者的正常非癌細(xì)胞中的CTRP6表達(dá)均為陰性，顯示出CTRP6在結(jié)腸癌組織的高表達(dá)。且CTRP6在結(jié)腸癌的表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、浸潤深度等均無相關(guān)性。根據(jù)此分布特征，CTRP6能否作為早期篩查結(jié)腸癌的一種標(biāo)志物，目前仍需臨床試驗(yàn)研究[20]證實(shí)，其靈敏度和特異度有待于進(jìn)一步研究。目前，已經(jīng)有利用重組載體轉(zhuǎn)染大腸桿菌的方法，誘導(dǎo)表達(dá)并提純，制備出了具有生物學(xué)活性的Trx-hCTRP6蛋白。這為探究CTRP6的生物學(xué)作用，并將其運(yùn)用到疾病的診治上，打下了基礎(chǔ)。

CTRP6在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、浸潤深度等均無相關(guān)性。