陳軍奎，劉 偉，王 欣，皮雄娥，費迪波，朱立穎

1.浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江 金華 321004； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學院植物保護與微生物研究所/農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全國家重點實驗室培育基地

腸道微生物在人體健康中的作用已經(jīng)有大量的研究報道。但腸道菌群結(jié)構(gòu)和組成在個體之間存在明顯的差異性和連續(xù)性，且這種特性又與年齡具有同步性。人出生后微生物就開始定植[1]，在嬰兒時期腸道微生態(tài)系統(tǒng)逐漸建立，在成年時期達到一個穩(wěn)定狀態(tài)，老年時期腸道菌群逐漸退化，致病菌增多[2]。通過宏基因組測序可以檢測到超過1 000種腸道微生物，主要分為四大門類：厚壁菌門、細菌、放線菌和變形菌門。微生物的定植最早發(fā)生在胎兒時期，有越來越多的證據(jù)表明在胎盤、羊水和胎糞就有微生物的存在[3-5]。隨著年齡的增長，腸道菌群也在不斷發(fā)生改變，當宿主的年齡在2～5歲時，腸道菌群會達到穩(wěn)定且平衡的狀態(tài)。每個個體的腸道菌群組成都是具有高度動態(tài)性和特異性，且隨著時間的推移會持續(xù)變化。與青年組相比，年齡相關的腸道菌群變化在老年組中個體差異更為明顯[4]。盡管不同個體間腸道菌群組成差異明顯，且受營養(yǎng)、生活方式、日照變化、性別、生理機能和種族等諸多因素的影響，但在生命的不同時期它都具有特定的組合方式和功能特征,例如在成年人的腸道內(nèi)，擬桿菌門和厚壁菌門是腸道菌群中最常見且最重要的組成部分[6]，而在嬰兒腸道內(nèi)以來自母乳的雙歧桿菌、乳酸菌、葡萄球菌和腸球菌等為主[7]。腸道菌群的這些特征在一定程度上被認為是宿主一種強有力的生理反應，并對宿主的發(fā)育和體內(nèi)平衡具有重要影響。鑒于腸道菌群在不同宿主的特異性和動態(tài)性與人生長周期的一致，現(xiàn)在已有學者認為腸道菌群具有預測一些代謝和疾病的能力，比如結(jié)直腸癌、餐后血糖升高、減重后體質(zhì)量反彈的概率甚至是神經(jīng)退行性疾病等。

人們早就認識到，腸道微生物可以幫助宿主抵御病原體，完善健康的腸道結(jié)構(gòu)和免疫系統(tǒng)，并幫助消化難以消化的膳食纖維，因此完整的腸道菌群是維持健康的重要因素。影響腸道微生物的因素很多，飲食就是其中最重要的一項。食物中難以消化的物質(zhì)為腸道微生物提供代謝基質(zhì)，由于不同的微生物利用特定的基質(zhì)，所以復雜飲食可以提供促進或抑制微生物生長的因子。益生元是指食物中宿主不能消化的成分在腸道中被腸道菌群選擇性代謝并對宿主產(chǎn)生有益影響的物質(zhì)。益生元可以促進腸道潛在有益菌的生長，主要是雙歧桿菌和乳酸菌。腸道微生物的老化進程可能會被益生元弱化，所以越來越多的研究在探索特定飲食成分對益生菌和菌群多樣性的影響，例如玉米為主的谷物食品可以提高志愿者糞便樣品中雙歧桿菌的豐度，豆類制品可以使厚壁菌的豐度減少，蔬菜可以提高腸道中擬桿菌/普雷沃氏菌的比例等。菊粉(INU)是從菊苣根中提取出來的，不過它也存在于小麥、洋蔥、香蕉、洋姜和韭菜等其他食物中；INU還廣泛應用在制藥業(yè)中。INU是由2～6個果糖通過β(2-1)糖苷鍵練成的骨架，末端通過α(1-2)糖苷鍵連接一個葡萄糖。這些β(2-1)骨架不能被唾液或胰酶水解，因此INU被認為具有益生元的效果。

本文中，我們比較了20～40歲人群和40～60歲人群的腸道菌群組成，并以淀粉(STA)和INU作為主要碳源來研究兩組人群的降解率、產(chǎn)氣量、短鏈脂肪酸(SCFA)產(chǎn)量及菌群的變化情況，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料本研究選擇了年齡為20～40歲和40～60歲各15名健康志愿者，20～40歲組男7名，女8名，平均年齡26.6歲，40～60歲組男8名，女7名，平均年齡50.8歲。

1.2研究方法

1.2.1 糞便樣品收集：所有的志愿者都是在近3個月內(nèi)飲食正常，并且未服用抗生素和其他藥物，且未接受過益生菌治療。收集志愿者晨起糞便，用厭氧磷酸緩沖液(PBS)配制成質(zhì)量濃度為100 g/L的糞便懸液，混勻后用0.125 mm的無菌金屬篩過濾除去大的食物殘渣。

1.2.2 體外發(fā)酵：本研究采用以前報道過的批量發(fā)酵系統(tǒng)進行[7]?；A培養(yǎng)基(YCFA)含有下列物質(zhì)：胰蛋白胨10 g/L；酵母提取物2.5 g/L；L-半胱氨酸1 g/L；血紅素2 ml/L；NaCl 0.9 g/L；CaCl2·6H2O 0.09 g/L；KH2PO40.45 g/L；K2HPO40.45 g/L；MgSO4·7H2O 0.09 g/L；維生素I 200 μl/L；刃天青(1 g/L)1 ml。維生素I溶液包括：生物素0.05 g/L,鈷胺素0.05 g/L,對氨基苯甲酸0.15 g/L,葉酸0.25 g/L,吡哆胺0.75 g/L。為了研究腸道菌群的代謝情況，我們在培養(yǎng)基中加入質(zhì)量濃度為8 g/L的INU作為唯一碳源，同時以STA培養(yǎng)基作為對照。培養(yǎng)基配置好后pH調(diào)節(jié)到6.5，然后厭氧條件下在10 ml的西林瓶中分裝5 ml培養(yǎng)基，密封后高壓滅菌。

將500 μl處理好的新鮮糞便接種液接種到培養(yǎng)基中，然后放置到37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，并分別在24 h和48 h的時間點取樣，然后以9 000 r/min離心3 min,取沉淀用來提DNA，上清用來做代謝分析。

1.2.3 薄層層細(TLC)：TLC可以直觀地觀察到碳的降解率和利用率。0.2 μl的樣品點在硅膠板上，然后將硅膠板底部浸泡在展開劑中，隨后將硅膠板浸沒在染色劑中染色，然后120 ℃干熱1 min顯色[8]。待顏色顯示出來后立即掃描拍照。通過Quantity One(Bio-Rad,美國)掃描分析TLC圖譜，并對每個樣品中的碳源殘留量進行定量計算。

1.2.4 DNA提?。簩⒓S便原液和48 h的樣品用來提取細菌DNA，按照QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒說明書的提取方法。提取完成后用Nano Drop ND-2000測其濃度。然后-80 ℃保存。

1.2.5 SCFA分析：用氣相檢測樣品中SCFA的濃度。樣品中的乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸的濃度通過GC檢測，柱子采用DB-FFAP的型號，用氫氣火焰電離檢測器，以巴豆酸作為內(nèi)標物。

1.2.6 16S rRNA 基因序列測序：細菌16S rRNA基因擴增的引物為341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)和 806R(5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)。二代測序由利貞生物醫(yī)藥科技公司檢測，從質(zhì)量濃度為20 g/L的瓊脂糖凝膠中提取擴增產(chǎn)物，用Axyprepdna凝膠提取試劑盒進行純化。根據(jù)標準，在Illuminamiseq平臺上，將純化的擴增產(chǎn)物合并成等摩爾序列和配對序列(2×250)。原始讀取存儲在NCBI序列讀取存檔(SRA)數(shù)據(jù)庫中。

1.3統(tǒng)計學分析采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件中的非參數(shù)檢驗計算各組間SCFA的產(chǎn)量、產(chǎn)氣量、降解率和Chao1指數(shù)、Shannon 指數(shù)和Simpson指數(shù)的差異。

2 結(jié)果

2.1志愿者原始糞便菌群差異比較兩組的16S rRNA測序結(jié)果，前15種高豐度菌中，只有擬桿菌豐度在40～60歲組中較高，其他菌無顯著差異(見圖1A)。40～60歲組的擬桿菌相較于20～40歲組有差異，而20～40歲中的差異菌群主要是一些豐度極低的菌群，所以兩組之間的菌群結(jié)構(gòu)比較相似(見圖1B)。兩組的Shannon和Simpson指數(shù)方面無顯著差異。兩組間的SCFA含量也無顯著差異(P>0.05，見圖1C)。

圖1 原始糞便菌群差異 A: 高豐度菌群箱線圖；B：Lefse分析；C：SCFA含量Fig 1 The difference of original fecal flora A: Boxplot of high fecal abundance; B： Lefse analysis; C: content of SCFA

2.2兩組人群對STA和INU的降解率為了比較兩組人群對STA和INU的降解率，我們對兩種培養(yǎng)基的發(fā)酵液做了TLC檢測分析。根據(jù)對每個樣本的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論是在24 h還是48 h，兩組STA和INU的降解率差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)，在24 h時STA已經(jīng)完全降解，而INU的降解率約70%。而20～40歲組與40～60歲組在48 h時INU的降解率差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)，在48 h時，20～40歲組INU已經(jīng)完全降解，而40～60歲組的平均降解率為90%。這些結(jié)果說明40～60歲組的腸道菌群的降解率明顯不如20～40歲組。表明40～60歲人群的腸道微生物對INU的利用已經(jīng)不如20～40歲人群，腸道菌群的功能已經(jīng)開始出現(xiàn)輕微退化(見圖2)。

2.324h的產(chǎn)氣情況為了探究兩組人群腸道菌群的產(chǎn)氣差異，我們在接種24 h后測了小瓶內(nèi)的氣壓值，以此來判斷菌群產(chǎn)生氣體的量。根據(jù)測得的每個人的氣壓數(shù)據(jù)可知，STA組中兩組人群產(chǎn)氣量一樣，但在INU組中，40～60歲組的個體差異較大，且40～60歲組的產(chǎn)氣量明顯高于20～40歲組，這說明老年人在服用INU后腸道菌群代謝會產(chǎn)生更多的氣體(見圖3)。

2.4兩組人群中SCFA的差異SCFA是使用GC 測定的。如圖4所示，通過比較不同組之間SCFA含量，發(fā)現(xiàn)在48 h時，在INU中，40～60歲組中乙酸的含量低于20～40歲組，而丙酸和丁酸的含量均高于20～40歲組，而總的SCFA含量兩組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。而在STA中，各SCFA的含量兩組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。這些結(jié)果表明，在服用INU后，兩組人群的腸道菌群對SCFA的代謝方式發(fā)生改變。

圖2 兩組人群對STA和INU的降解率；圖3 各組間產(chǎn)氣差異比較 Fig 2 Degradation rates of STA and INU in two groups；Fig 3 Comparison of gas production among each group

2.5STA和INU對兩組人群腸道菌群的影響為了解INU和STA對腸道菌群的影響，在發(fā)酵48 h后對發(fā)酵樣品進行16S rRNA測序，結(jié)果如圖5所示，在以STA為碳源的培養(yǎng)基發(fā)酵后，20～40歲組中的Bifidobacterium、Ruminiclostridium5、Catenibacterium、Megasphaera、Comamonas、Neisseria較40～60歲組差異明顯；而40～60歲組中的Adlercreutzia、Lactococcus、Faecalitalea、Turicibacter、Mitsuokella相對20～40歲組豐度較高。

在以INU為碳源的培養(yǎng)基發(fā)酵后，在20～40歲組中，Bifidobacterium、Lactobacillus、Christensenella、Catenibacterium、Comamonas、Actinobacillus等差異顯著。在40～60歲組中，Enterococcus、Peptostreptococcus、Clostridium、Phascolarctobacterium、Rhodospirillales、Delftia、Escherichia-Shigella等差異顯著。其中，有報道指出Escherichia-Shigella、Peptostreptococcus、Enterococcus等含量升高伴隨著腸炎[9]、酒精性脂肪肝[10]等疾病的發(fā)生。

圖4 發(fā)酵液中SCFA含量 A：SCFA總量；B：乙酸產(chǎn)量；C：丙酸產(chǎn)量；D：丁酸產(chǎn)量 Fig 4 Content of SCFA in fermentation broth A: total amount of SCFA; B: acetic acid yield; C: propionic acid yield; D: butyric acid yield

圖5 發(fā)酵液中菌群的Lefse分析圖 A：STA組；B：INU組

3 討論

越來越多的研究結(jié)果認為,人體腸道微生態(tài)的變化與宿主免疫系統(tǒng)老化和與年齡有關的慢性疾病發(fā)病有關[11]。但對于“老年人”似乎無一個統(tǒng)一的定義，例如“65歲以上”[12]、“60歲以上”[13]或“70歲以上”[14]。ODAMAKI等[15-16]研究表明,腸道細菌結(jié)構(gòu)從4歲開始一直到70歲都是處于一個平穩(wěn)時期，70歲以后才發(fā)生明顯的變化，主要表現(xiàn)在Actinobacteria的數(shù)量減少，變形桿菌數(shù)量增加。我們的研究中卻發(fā)現(xiàn)40～60歲人群糞便樣品中擬桿菌的豐度較20～40歲組顯著升高。除此之外，糞便SCFA含量無明顯差異?？傮w來說，如果僅僅通過16S rRNA測序分析糞便腸道菌群結(jié)構(gòu)和SCFA的話，20～40歲組與40～60歲組腸道微生態(tài)的結(jié)構(gòu)和主要代謝產(chǎn)物較相似。

體外發(fā)酵系統(tǒng)是通過建立一個適宜腸道微生態(tài)生長的環(huán)境系統(tǒng)，可以體外比較研究腸道微生物對膳食纖維或其他食物組分降解和發(fā)酵的速度。體外腸道模擬系統(tǒng)是研究非宿主相關因素對脊椎動物腸道微生物學特性影響的有效工具[17]。人體腸道微生物發(fā)酵膳食纖維后的主要代謝產(chǎn)物包括乙酸、丙酸和丁酸為主的SCFA、氫氣、甲烷和二氧化碳[18]。參與多糖降解的腸道細菌主要有擬桿菌、雙歧桿菌、羅氏菌屬和瘤胃球菌屬，以及一些梭菌屬和腸球菌[19]。本研究中，20～40歲與40～60歲雖然在糞便腸道菌群組成上無顯著差異，但在腸道菌群代謝功能方面，兩組間差異顯著。例如，40～60歲組的INU降解效率和降解能力不如20～40歲組，而產(chǎn)氣量明顯高于20～40歲組，這些結(jié)果表明老年人服用INU后易出現(xiàn)腹脹，大量的腸道氣體甚至引起腹痛或腸易激綜合征[20]。結(jié)腸微生物通過發(fā)酵碳水化合物和蛋白質(zhì)產(chǎn)生SCFA，主要包括乙酸、丙酸、異丁酸、異戊酸、戊酸。發(fā)酵48 h后，20～40歲組乙酸含量明顯高于40～60歲組，40～60歲組的丙酸和丁酸含量較高，但差異無統(tǒng)計學意義。醋酸能調(diào)節(jié)食欲[21]，丁酸是腸道細胞的主要能量來源[22]，丙酸可以調(diào)節(jié)糖異生過程和飽腹感信號[23]。因此，推測老年人服用INU后，菌群代謝造成的乙酸含量下降、丙酸和丁酸升高更容易引起飽腹感，而20～40歲組則未見此現(xiàn)象。本研究結(jié)果表明，盡管兩個年齡組總體來說仍處于壯年時期，糞便腸道菌群組成并無明顯差異，但平均年齡50歲人群的腸道菌群對膳食纖維INU的降解代謝能力明顯不如平均年齡30歲人群。

越來越多的證據(jù)證明環(huán)境因素在確定腸道菌群結(jié)構(gòu)與功能方面起到重要作用。而膳食則是改變腸道微生物組成的一個最重要因素。對近交系小鼠的研究表明，大量改變膳食營養(yǎng)素能在1 d內(nèi)顯著改變腸道微生物群落[24-25]。在本研究中，STA中兩組的發(fā)酵液中菌群差異不明顯，這可能是由于試驗中采用的可溶性淀粉在人體中是容易被消化吸收的[26]，腸道內(nèi)的梭菌屬、類桿菌等都是直接參與STA代謝的[27]，而這些菌在兩組人群內(nèi)豐度較高，所以STA的利用率無較大差異。INU能在體外發(fā)酵模型中48 h內(nèi)顯著改變糞便微生物群落結(jié)構(gòu)。對于40～60歲組，添加INU使E.coli、Delftia、Peptostreptococcus等數(shù)量增加，這些細菌大部分都屬于條件致病菌。相反，添加INU使20～40歲組的益生菌，如Bifidobacterium、Leuconostoc、Acidaminococcus等含量增加。這個結(jié)果表明，雖然大量的基礎科學已證明INU有益于宿主的免疫反應代謝過程和神經(jīng)內(nèi)分泌途徑，但益生元的選擇和用量需要考慮年齡的差異。

本研究結(jié)果再一次證明了腸道菌群在成年后一直保持穩(wěn)定，但會隨著年齡的增加而發(fā)生變化[28]。僅用16S rRNA測序糞便中的菌群結(jié)構(gòu)可能無法準確區(qū)分生命過程中腸道菌群功能的變化，腸道菌群功能的衰退可能遠遠早于菌群結(jié)構(gòu)的退化。探討腸道菌群功能的變化，并將腸道菌群的功能和菌群的結(jié)構(gòu)及年齡聯(lián)系起來，可為個性化飲食和腸道疾病的治療提供更精確更合理的指導意見。