李曉芬，張公信，熊華斌，馬肖艷，張海芬，何耀瑩，高云濤

(1.云南民族大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境學(xué)院 云南 昆明 650500；2.云南植物藥業(yè)有限公司 云南 昆明 650500)

自由基氧化損傷是現(xiàn)代許多重大疾病的源泉，也是引起機(jī)體衰老的根本原因[1-3].天然產(chǎn)物清除自由基的抗氧化劑活性研究是目前研究的熱點(diǎn)[4-5].近年來(lái)從傳統(tǒng)中藥和民族藥中篩選和測(cè)定天然抗氧化活性物質(zhì)的方法備受關(guān)注[6-8].

白花蛇舌草(HedyotisdiffusaWilld.)為茜草科植物，主要分布在我國(guó)南方地區(qū)，味微苦、性寒、全草藥用，作為一種著名的具有多種生理活性的中草藥，已被廣泛應(yīng)用于臨床治療，包括肝炎，扁桃體炎，咽喉腫痛，胃腸炎、惡性腫瘤等疾病[9].研究表明，白花蛇舌草富含多糖、微量元素以及萜類(lèi)、黃酮類(lèi)多種抗氧化活性成分，具有抗癌、抗炎、增強(qiáng)免疫力等功效.藥理學(xué)研究表明，槲皮素，山奈酚，咖啡酸，蘆丁是白花蛇舌草中的主要活性成分，有文獻(xiàn)報(bào)道這些天然活性物質(zhì)具有多種藥理特性，可作為抗菌、抗炎、抗氧化、抗癌的物質(zhì)[10-14].為了更科學(xué)合理地開(kāi)發(fā)利用這種天然藥物，本文建立了一種快速高效能夠同時(shí)測(cè)定白花蛇舌草提取物中4種多酚物質(zhì)的分析方法，為白花蛇舌草的藥理活性研究提供了科學(xué)依據(jù).

1 材料、儀器與試劑

1.1 材料

白花蛇舌草購(gòu)于菊花村中藥材市場(chǎng)，經(jīng)篩選除雜質(zhì)后粉碎過(guò)0.441 mm篩.

1.2 儀器

Agilent 1200 Series HPLC(美國(guó)安捷倫公司)；8453型UV-Vis分光光度計(jì)；AS3120A超聲清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；層析柱(40 mm×10 mm)；恒溫水浴鍋.

1.3 試劑

DPPH(1, 1-二苯基-2-苦基肼，純度﹥99%，Sigma公司)，標(biāo)準(zhǔn)品咖啡酸，蘆丁，槲皮素和山奈酚(購(gòu)自Sigma公司，純度 >98%)；甲醇、磷酸(TED IA，色譜純)；所用試劑均為分析純.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 對(duì)照品溶液的制備

參考文獻(xiàn)[15]，準(zhǔn)確稱(chēng)取咖啡酸2.0 mg、蘆丁4.0 mg、槲皮素1.0 mg和山奈酚5.0 mg，置于10.00 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成咖啡酸(0.3 mg/mL)，蘆丁(0.4 mg/mL)，槲皮素(0.1 mg/mL)和山奈酚(0.5 mg/mL)對(duì)照品溶液.4 ℃保存?zhèn)溆茫褂脮r(shí)稀釋到所需濃度即可.

2.2 供試品溶液的制備

參考文獻(xiàn)[16]，準(zhǔn)確稱(chēng)取3.0 g白花蛇舌草樣品，加入甲醇溶液25 mL，室溫下超聲浸提30 min后抽濾，用甲醇洗滌濾渣，濾渣再重復(fù)提取3次后合并濾液，濾液蒸發(fā)濃縮后定容于容量瓶中.使用時(shí)超聲除氣泡，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾除渣后，即得供試品溶液.

2.3 HPLC法白花蛇舌草甲醇提物主要成分分析

色譜條件為色譜柱：Agilent XDB-C18(75 mm×2.1 mm，2.7 μm)；柱溫：35 ℃；流動(dòng)相 A：甲醇；流動(dòng)相 B：磷酸/水(0.5 %，V/V)；梯度洗脫程序：0～3 min (65% A)；3～10 min (50% A),10～12 min (65% A).流速：0.3 mL /min；進(jìn)樣量：2 μL；紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；分析時(shí)間為10 min.

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

3.1.1 最佳檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

用二極管陣列檢測(cè)器(DAD)對(duì)槲皮素，山奈酚，咖啡酸，蘆丁對(duì)照品甲醇溶液的紫外-可見(jiàn)光(200～400 nm) 進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描發(fā)現(xiàn)，4種多酚物質(zhì)的吸收峰集中在360 nm附近，故選擇360 nm作為其檢測(cè)波長(zhǎng).

3.1.2 流動(dòng)相的選擇

在很多酸性物質(zhì)存在的條件下，pH值對(duì)保留時(shí)間的影響很大.文中選擇了醋酸、磷酸等作為流動(dòng)相，由于4種多酚物質(zhì)的極性相差較大，采用了不同的洗脫方式(等度洗脫及各種梯度洗脫)和不同流動(dòng)相體系(包括甲醇-水-醋酸溶液、甲醇-水-磷酸溶液V/V) 對(duì)色譜條件進(jìn)行優(yōu)化.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，流動(dòng)相甲醇-水-磷酸(V/V)之比對(duì)峰形和保留時(shí)間有明顯影響.當(dāng)采用等度洗脫時(shí)，1、2號(hào)峰在短時(shí)間內(nèi)很難較好地分離，故采用梯度洗脫方式.不加磷酸時(shí)，色譜峰出現(xiàn)不同程度的拖尾；加入磷酸后，隨著濃度的增加，色譜峰的對(duì)稱(chēng)性增加.考慮到色譜柱的耐酸范圍，選0.5%磷酸溶液作為B相洗脫液.選擇不同成分和比例的流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，甲醇(A)-0.5%磷酸(B)作為流動(dòng)相時(shí)，4種多酚物質(zhì)具有最佳分離效果.采用梯度洗脫分離方法及洗脫程序?yàn)椋?～3 min (65% A),3～10 min (50% A),10～12 min (65% A).流速0.3 mL/min，在此條件下，測(cè)得的色譜圖見(jiàn)圖2(A)和圖2(B).可見(jiàn)，4種多酚物質(zhì)均得到較好的分離.

3.1.3 流速對(duì)分離度的影響

在一定流速范圍內(nèi)，隨著流速的減少，柱效會(huì)提高，分離度變大.但若流速過(guò)慢，分析時(shí)間延長(zhǎng)，縱向擴(kuò)散的影響變大，會(huì)導(dǎo)致柱效降低.雖然提高流速可縮短分析時(shí)間，但如果流速過(guò)高，物質(zhì)來(lái)不及分離就被洗出，分離效果差，而且還會(huì)損壞泵頭和色譜柱.因此，流速對(duì)分離度的影響也很大.最終確定流速為0.3 mL/min時(shí)，出峰時(shí)間和分離效果均較滿意.

3.1.4 柱溫的選擇

在其他色譜條件不變的條件下，分別選擇柱溫為20、25、30、35、40 ℃進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)柱溫對(duì)樣品的分離效果有很大的影響.當(dāng)柱溫太低時(shí)有些化合物幾乎不能分離開(kāi)，當(dāng)柱溫太高時(shí)樣品中的一些化合物會(huì)被分解，隨著化合物碎片流出的速度增加會(huì)使分離度下降.為了得到較好的分離效果和重現(xiàn)性較好的色譜圖應(yīng)該選擇一個(gè)合適的溫度范圍.試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)柱溫為35 ℃時(shí)4種多酚物質(zhì)的分離效果最佳，故選擇柱溫為35 ℃進(jìn)行測(cè)定.

3.2 白花蛇舌草甲醇提取物的定性分析

在最佳色譜條件下測(cè)定槲皮素、山奈酚、咖啡酸，蘆丁4種標(biāo)準(zhǔn)品溶液的色譜圖如圖2(A)所示，白花蛇舌草甲醇提取物的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖如圖2(B)所示.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明4種多酚物質(zhì)能夠成功的彼此分離.所有的化合物在一定的濃度范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系(R2>0.999).

3.3 方法驗(yàn)證

3.3.1 線性關(guān)系

精密吸取對(duì)照品混合溶液0.1、0.16、0.25、0.5、1.0 mL至5個(gè)10.0 mL容量品中用甲醇稀釋至刻度.取上述對(duì)照品混合溶液20 μL進(jìn)樣并進(jìn)行準(zhǔn)確分析，測(cè)定其峰面積，采用外標(biāo)法以峰面積A對(duì)質(zhì)量濃度C進(jìn)行線性回歸.槲皮素、山奈酚、咖啡酸和蘆丁的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和保留時(shí)間如表1所示：4種多酚物質(zhì)在一定的濃度范圍具有較好的線性關(guān)系(R2>0.999).對(duì)照品溶液的色譜圖如圖2(A)所示，槲皮素、山奈酚、咖啡酸和蘆丁的保留時(shí)間分別為6.400、8.121、2.592、3.424 min.

表1 4種多酚物質(zhì)的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和保留時(shí)間

3.3.2 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取供試品溶液20.0 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，進(jìn)行測(cè)定，槲皮素，山奈酚、咖啡酸和蘆丁峰面積積分值的RSD分別為1.4%、1.6%、1.5%、1.8%，此結(jié)果表明具有良好的精密度.

表2 精密度測(cè)定結(jié)果

3.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱(chēng)量相同質(zhì)量的白花蛇舌草樣品共5份，按“2.2”操作制備供試品溶液后，在以上色譜條件下進(jìn)行測(cè)定.槲皮素，山奈酚、咖啡酸和蘆丁含量的RSD分別為2.37%，2.16%，2.07%，2.23%，以上數(shù)據(jù)表明分析方法具有良好的重現(xiàn)性.

3.3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

在以上色譜條件下，對(duì)供試品溶液在8 h之內(nèi)每隔2 h進(jìn)行考察，平行測(cè)定4次，結(jié)果槲皮素，山奈酚、咖啡酸和蘆丁峰面積積分值的RSD(n=4)分別為2.32%、2.15%、2.23%、2.20%，測(cè)定結(jié)果表明4種多酚物質(zhì)的含量在8 h之內(nèi)保持穩(wěn)定.

3.3.5 加樣回收率試驗(yàn)

進(jìn)行加樣回收率試驗(yàn)以評(píng)價(jià)分析方法的準(zhǔn)確性.精密稱(chēng)量白花蛇舌草樣品0.3 g，共5份，每份分別加入1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液(質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的槲皮素，0.5 mg/mL 的山奈酚，0.3 mg/mL的咖啡酸和0.4 mg/mL的蘆丁)進(jìn)行測(cè)定.槲皮素、山奈酚、咖啡酸和蘆丁的平均加樣回收率(n=5)分別為99.3%、99.4%、98.5%、98.7%，RSD分別為2.0%、1.84%、2.15%、1.90%.

表3 回收率測(cè)定結(jié)果(n=5)

3.4 樣品的測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取2.0 g 白花蛇舌草樣品3批，按“2.2”項(xiàng)下操作制備供試品溶液，取20 μL濾液進(jìn)樣進(jìn)行測(cè)定，每批平行測(cè)定3次，用回歸方程計(jì)算出槲皮素、山奈酚、咖啡酸和蘆丁含量，結(jié)果見(jiàn)表4.

表4 白花蛇舌草中4種多酚含量的測(cè)定結(jié)果(n=3)

4 結(jié)語(yǔ)

本文用HPLC法同時(shí)測(cè)定了白花蛇舌草中4種多酚物質(zhì)(槲皮素、山奈酚、咖啡酸和蘆丁)的含量.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，白花蛇舌草中槲皮素、山奈酚、咖啡酸和蘆丁的含量分別為7.69，41.52，27.77，17.33 μg/g.該方法具有較好的準(zhǔn)確度、精密度和重現(xiàn)性，提供了一種快速測(cè)定白花蛇舌中4種多酚物質(zhì)的分析方法.