杜 剛，陸小凱，劉仙花，洪耀強(qiáng)，楊海英

(1.云南民族大學(xué) 民族藥資源化學(xué)國家民族事務(wù)委員會-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 云南 昆明 650500； 2.云南民族大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明 650500)

稻谷是我國的主要糧食作物之一，也是世界上第二大農(nóng)作物，我國年產(chǎn)量超過2.0億噸[1].淘米水即洗米后留下的水，主要含有米糠和糊粉層的營養(yǎng)成分，包括蛋白質(zhì)、膳食纖維、淀粉、谷維素、維生素和礦物質(zhì)等多種生物活性成分[2].米糠蛋白具有抗癌活性和保健功能[3]，米糠肽是米糠蛋白經(jīng)蛋白酶水解得到的低分子量多肽，具有低過敏性、易溶解特點(diǎn)[4-5].Choi等[6]對米糠進(jìn)行CO2超臨界萃取，提取物表現(xiàn)出良好的生發(fā)效果，毛囊顯著增多.

云南傣族人把每天的淘米水放入盆或桶等容器，進(jìn)行自然發(fā)酵，傳統(tǒng)發(fā)酵淘米水用于洗發(fā)，具有去頭屑、潤發(fā)、亮發(fā)和促使頭發(fā)變黑、變粗等作用[7].淘米水自然發(fā)酵過程伴隨pH下降，推測是淘米水在發(fā)酵過程產(chǎn)生了有機(jī)酸.目前測定有機(jī)酸的主要分析方法有氣相色譜法[8],離子色譜法[9]、離子排斥色譜法[10-11]，毛細(xì)管電泳[12]和反相高效液相色譜法[13-15].為研究淘米水發(fā)酵過程有機(jī)酸的種類，本文采用高效液相色譜法對淘米水發(fā)酵物中的有機(jī)酸測定,以逐步揭示傣族用淘米水對頭發(fā)起養(yǎng)護(hù)作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，為傳統(tǒng)發(fā)酵淘米水在日化工業(yè)的開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).淘米水發(fā)酵液中有機(jī)酸的HPLC分析方法目前尚無報道.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑

淘米水為云南省西雙版納傣族自治州勐臘縣曼那村傳統(tǒng)發(fā)酵2 d的淘米水，傣族香米云南省勐?？h傣鄉(xiāng)米廠.

甲醇為色譜純，F(xiàn)isher公司；哇哈哈純凈水；乙酸、乳酸(純度>99%)；NaH2PO4(AR)、磷酸(AR)等購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀，包括DAD紫外檢測器，Agilent色譜工作站(美國安捷倫公司)；LE204E電子天平(瑞士梅特勒托利多)；BINDER VD53真空干燥箱(德國賓得)；H2-16KR臺式離心機(jī)(湖南可成).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品溶液的制備

取20 mL淘米水發(fā)酵液，進(jìn)行12 000 r/min離心10 min，取上清液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，4 ℃的冰箱冷藏備用.

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品的配制

取經(jīng)40 ℃減壓干燥至恒重的乙酸、乳酸對照品適量，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，用超純水溶解并定容，過0.45 μm微孔濾膜后置于4 ℃的冰箱中保存.配制的對照品混合標(biāo)準(zhǔn)溶液每毫升含4.950 mg乳酸、3.144 mg乙酸，乳酸單標(biāo)溶液質(zhì)量濃度為 17.09 mg/mL，乙酸單標(biāo)溶液質(zhì)量濃度為 2.005 mg/mL.

1.3.3 流動相的考察

為了得到良好的分離效果，依次考察了不同物質(zhì)的量濃度的NaH2PO4磷酸鹽緩沖溶液(0.01、0.02、0.03 mol/L)，不同pH值的流動相(2.0、2.3、2.5、2.9、3.5、4.0、4.5、5.0)，不同比例甲醇(1%、10%、20%、30%、70%)對色譜分離的影響.從目標(biāo)化合物分離度、響應(yīng)值、保留時間、峰形各方面進(jìn)行比較.

1.3.4 流速的考察

考察流動相不同流速(0.4、0.6、0.8、1 mL/min)對色譜分離的影響.

1.3.5 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB-Aq(4.6 mm×150 mm，5 μm,)，流動相：甲醇-20 mmol/L，pH為2.0的NaH2PO4磷酸鹽緩沖溶液(體積比1∶ 99)，流速：0.4 mL/min，柱溫：25 ℃，檢測波長：210 nm.

1.3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取4.950 mg/mL乳酸，3.144 mg/mL乙酸的對照品混合溶液1、5、10、20、50 μL，注入HPLC色譜儀，按照“1.3.5”的色譜條件測定，以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程.

1.3.7 穩(wěn)定性考察

取樣品溶液(1.3.1方法配制)，放置0、2、4、8、16、24 h后，精密吸取樣品溶液5 μL注入HPLC色譜儀,按“1.3.5”項(xiàng)下色譜條件測定，得到峰面積A，計算RSD值，考察樣品的穩(wěn)定性.

1.3.8 精密度考察

在 “1.3.5”色譜條件下，精密吸取含4.950 mg/mL乳酸、3.144 mg/mL乙酸的對照品混合溶液5 μL, 注入HPLC色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣3次，測定得峰面積A，計算RSD值.

1.3.9 回收率試驗(yàn)

精密量取已知含量的淘米水發(fā)酵液樣品5份，每份2 mL，分別加入17.09 mg/mL乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5，0.8，1，1.2，1.5 mL，2.005 mg/mL乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5，0.8，1，1.2，1.5 mL，按照“1.3.1”項(xiàng)下處理樣品，按“1.3.5”色譜檢測條件進(jìn)行測定，計算乳酸、乙酸平均回收率.

1.3.10 樣品測定

按“1.3.5”項(xiàng)下色譜條件，精密吸取樣品溶液5 μL，采用外標(biāo)法對淘米水發(fā)酵液樣品中的有機(jī)酸含量進(jìn)行計算.

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相的選擇

在“1.3.3”項(xiàng)下方法，經(jīng)過試驗(yàn)對比篩選，當(dāng)NaH2PO4緩沖鹽濃度為0.02 mol/L，甲醇-NaH2PO4緩沖鹽體積比例為1∶ 99，流動相pH為2.0時，樣品溶液得到最佳分離效果.

2.2 流速的選擇

按“1.3.4”項(xiàng)下方法實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)流速在0.4 mL/min時保留時間適當(dāng)，峰形較好，故選擇流動相流速為0.4 mL/min.

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按“1.3.6”項(xiàng)下方法測定，繪制乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1，乳酸回歸方程為y=570.66x+11.252，R2=1，表明乳酸在0.495～24.75 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.繪制乙酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2，乙酸回歸方程為y=1 533.2x-307.72，R2=0.993 2，表明乙酸在0.314 4～15.72 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

按“1.3.7”項(xiàng)下方法測定峰面積A，計算峰面積的RSD，乳酸峰面積的RSD為0.58%，乙酸峰面積的RSD為2.50%，表明樣品放置24 h穩(wěn)定.

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

按“1.3.8”項(xiàng)下方法實(shí)驗(yàn)，測得峰面積A，計算峰面積的RSD值，乳酸的RSD為0.53%，乙酸的RSD為0.46%，表明HPLC儀器的精密度良好.

2.6 回收率試驗(yàn)

按“1.3.9”項(xiàng)下方法實(shí)驗(yàn)，分別計算乳酸、乙酸回收率，乳酸平均回收率為95.12%，RSD為2.17%(n=5)；乙酸平均回收率為92.9%，RSD為4.25%(n=5).

2.7 淘米水發(fā)酵液中有機(jī)酸的分析

按“1.3.10”項(xiàng)下方法，對樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行檢測，確定樣品溶液中含有乳酸①和乙酸②2種有機(jī)酸，對照品和樣品溶液的HPLC色譜圖如圖3、圖4所示.淘米水發(fā)酵液中乳酸①含量為8.575 mg/mL，乙酸②含量為1.040 mg/mL.

3 結(jié)語

本實(shí)驗(yàn)建立淘米水發(fā)酵樣品中有機(jī)酸含量測定的方法，適用于淘米水發(fā)酵液中有機(jī)酸的測定.樣品經(jīng)離心、過濾，檢測條件為：色譜柱Agilent Zorbax SB-Aq(5 μm，4.6 mm×150 mm)；紫外檢測波長210 nm；流動相(V/V)為1%甲醇-99%的20 mmol/L NaH2PO4溶液(pH 2.0)；流速0.4 mL/min；柱溫25 ℃.