莫文法， 張錫流

1桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科(廣西桂林 541001)； 2廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科(廣西南寧 530023)

鼻咽癌是鼻咽部上皮組織發(fā)生的惡性腫瘤,是我國高發(fā)惡性腫瘤之一，多見于我國廣東、廣西、福建等南方地區(qū)，有明顯的地域性，男性患者多于女性患者，發(fā)病率為耳鼻喉頭頸部惡性腫瘤之首。鼻咽癌有易浸潤性、高轉(zhuǎn)移性和易復(fù)發(fā)的臨床特點，但鼻咽癌的病因及發(fā)生機制目前尚未完全明確。2005年Glinsky等[1]通過mRNA微集陣列(microarray)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)并總結(jié)了包括泛素特異性肽酶22基因(ubiquitin specific peptidase 22，USP22)等11個基因在內(nèi)的一組癌死亡標簽(death-from-cancer signature)。癌死亡標簽在多數(shù)腫瘤細胞中高度表達，編碼促使腫瘤生長的蛋白質(zhì)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥性和預(yù)后復(fù)發(fā)等密切相關(guān)，因此，也被認為是腫瘤細胞的標記基因[2]。USP22是腫瘤干細胞標志家族中一個成員，屬于去泛素化酶蛋白酶超家族，具有去泛素化的作用。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)USP22在人類肺癌、腎癌、腸癌、胃癌、甲狀腺癌等多種腫瘤中高表達[3-7]。國內(nèi)對USP22在鼻咽癌方面的報道罕見，故本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測USP22在鼻咽癌組織中的表達, 并初步分析USP22蛋白的表達與患者臨床病理因素和預(yù)后之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集隨訪資料完整的2013年1月至2014年12月桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科存檔的60例鼻咽癌組織標本作為實驗組。其中非角化性癌57例，角化性鱗狀細胞癌3例；男46例，女14例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移50例，未發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移10例；年齡32～80歲，中位年齡50歲。另隨機收集同期20例鼻咽黏膜慢性炎組織標本作為對照組，其中男11例，女9例，年齡18～68歲，中位年齡37歲。所選標本均為手術(shù)前未接受過任何相關(guān)放療或化療治療的標本。

1.2 試劑 兔抗人USP22多克隆抗體購自Abcam公司，貨號ab71732；即用型快捷免疫組化MaxVision試劑盒、DAB顯色試劑盒和抗原修復(fù)液等試劑購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 臨床隨訪 盡可能對2013—2014年期間在我院就診和治療的每例鼻咽癌患者進行隨訪，隨訪方式主要通過電話、患者再次到門診診查或再次住院治療資料的方式進行。每次隨訪做好記錄，第1年半年隨訪1次，第2～3年每3個月隨訪1次，第3年以后每月隨訪1次，記錄患者的總生存期(OS)和無進展生存期(PFS)，以病理確診日期作為觀察起點，隨訪至2017年12月。最后選取資料完整的60例鼻咽癌患者的石蠟保存標本作為研究對象。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色 采用免疫組織化學(xué)MaxVision法進行染色,所有實驗操作步驟均按說明書嚴格進行。主要步驟：3～4 μm厚切片，恒溫箱60℃烤片2 h以上，二甲苯脫蠟，梯度酒精和自來水水化，高溫高壓修復(fù)(pH=9.0的EDTA抗原修復(fù)液)，3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，PBS緩沖液沖洗，滴加USP22(1∶200稀釋)一抗，室溫下孵育60 min，PBS緩沖液沖洗，滴加二抗，室溫下孵育15 min，PBS緩沖液沖洗3次，DAB顯色；蘇木素復(fù)染，脫水，封片等。用已知的陽性的乳腺癌切片作為陽性對照, 用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.3.3 免疫組化結(jié)果判定 結(jié)果判定參照其他學(xué)者[7-9]免疫組化二級記分法判定：陽性細胞數(shù)比例：≤5%為0分，6%～25% 1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；染色強度分類：無色為0分,淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。根據(jù)切片中陽性細胞數(shù)比例和細胞著色強度，兩種評分的乘積進行判定，0分為陰性(-)，1～2分為弱陽性(+)，3～4分為陽性(++)，大于4分為強陽性(+++)，統(tǒng)計學(xué)處理時將分級≥1分歸為陽性。以上結(jié)果由至少2位病理科醫(yī)師在雙盲情況下觀察確定。

2 結(jié)果

2.1 USP22的表達 USP22陽性染色部位為細胞質(zhì)，陽性染色可見細胞胞質(zhì)呈棕黃色，見圖1。USP22蛋白在鼻咽癌組織中的陽性表達率明顯高于在鼻咽部黏膜慢性炎組織的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

A：USP22在鼻咽黏膜慢性炎性組織中的表達(×200)；B：USP22在鼻咽癌組織中的陰性表達(×200)；C：USP22在鼻咽癌組織中的陽性表達(×200)；D：USP22在鼻咽癌組織中的陽性表達(×400)

圖1 兩種組織中USP22的表達(MaxVision)表1 兩組標本組織中USP22蛋白的陽性表達 例

2.2 USP22的表達與鼻咽癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 USP22陽性表達率與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著的相關(guān)性(P<0.05), 而與患者性別、年齡、病理分型等臨床病理特征無明顯相關(guān)性(P>0.05)，見表2。

2.3 USP22蛋白和患者預(yù)后的關(guān)系 本研究發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌組織中，USP22陽性表達患者的3年OS、PFS均明顯低于USP22陰性表達患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表2 USP22的表達與 NPC臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 例

表3 鼻咽癌組織中USP22蛋白表達與患者預(yù)后的關(guān)系 例(%)

3 討論

3.1 USP22在鼻咽癌組織中的表達 鼻咽癌是鼻咽部上皮組織發(fā)生的常見的惡性腫瘤，但鼻咽癌的病因及發(fā)生機制目前尚未完全明確。USP22位于人類17號染色體(17p11.2)上，由14個外顯子組成，其開放讀框由1 578個堿基組成，可編碼525個氨基酸。USP22是腫瘤干細胞標志家族中一個成員, 屬于去泛素化酶蛋白酶超家族，具有去泛素化的作用，通過對底物靶分子的去泛素化修飾作用調(diào)節(jié)細胞內(nèi)多種基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮生物學(xué)功能[10]。目前研究認為USP22是惡性腫瘤表型的1個關(guān)鍵啟動子，其作用是調(diào)節(jié)核受體和致癌信號[11]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)USP22在人類許多惡性腫瘤細胞中呈高表達，如USP22在乳腺癌、食管癌、胃癌、直腸癌等多種腫瘤中高表達。但目前國內(nèi)對USP22在鼻咽癌方面的報道罕見，故本研究我們采用免疫組織化學(xué)法對60例鼻咽癌患者和20例鼻咽黏膜慢性炎患者組織中的USP22的表達進行檢測，60例鼻咽癌組織中，有36例組織中USP22表達呈陽性，陽性表達率60%(36/60)；20例對照組(鼻咽黏膜慢性炎組織)中，僅有2例USP22表達陽性，陽性表達率為10%(2/20)，USP22在鼻咽癌中的陽性表達率明顯高于鼻咽黏膜慢性炎組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這與近年來許多國內(nèi)外權(quán)威雜志報道USP22在其他惡性腫瘤中有過表達的情況一致[12]，USP22可能在鼻咽癌腫瘤細胞的生長過程中扮演著重要角色，USP22可能是鼻咽癌病理診斷與鑒別診斷的指標之一。我們認為對可疑為鼻咽癌的病檢活檢組織檢測USP22蛋白的表達情況可能有助于鼻咽癌的病理診斷與鑒別診斷。本實驗結(jié)果USP22在鼻咽癌組織中的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著的關(guān)系(P<0.05)，而與患者性別、年齡、病理分型等臨床病理特征無明顯相關(guān)性(P>0.05)，USP22的表達在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織中比無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，這表明USP22可能參與鼻咽癌的淋巴轉(zhuǎn)移過程。這與張琳等[5]報道USP22在結(jié)直腸癌組織中的表達與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝臟轉(zhuǎn)移及Duke′s分期有關(guān)；鄭文鳳等[9]報道USP22在食管癌的表達與腫瘤浸潤深度及組織學(xué)分級有關(guān)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、年齡、性別無關(guān)；于金玲等[6]報道USP22在胃癌的表達與腫瘤分化程度、浸潤深度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)，而與患者的年齡、性別、腫瘤大小無相關(guān)性等報道有些不一致，可能提示USP22在人類不同惡性腫瘤組織中的表達與其臨床病理因素的關(guān)系不盡相同，也可能是由于各種原因無法對每一例患者一直隨訪，篩選研究病例的結(jié)果，以及由于本次實驗收集的樣本不夠豐富、女性患者偏少、各種鼻咽癌病理分型的比例不夠理想等原因也可能導(dǎo)致在醫(yī)學(xué)統(tǒng)計學(xué)上還不能很好地反映出其表達規(guī)律，還值得需要我們更進一步的探究。

3.2 USP22蛋白與臨床預(yù)后 由于本研究對象確診時間尚未足5年，故暫時只統(tǒng)計3年OS和PFS指標，與USP22表達進行相關(guān)性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，USP22蛋白陽性表達的患者預(yù)后較差，USP22陰性表達的患者3年OS和PFS率明顯高于陽性表達組，與于金玲等[6]報道在胃癌患者中USP22蛋白高表達的患者預(yù)后差，5年生存率低；常靜[13]報道在宮頸癌患者中USP22蛋白陽性表達患者的3年生存時間顯著低于USP22蛋白陰性表達患者的情況基本一致。提示檢測鼻咽癌患者的USP22蛋白表達情況有助于臨床判斷患者的預(yù)后。

3.3 USP22基因與鼻咽癌治療 目前以泛素蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin proteasome system，UPS)為靶點的抗腫瘤藥物逐年增多，硼替佐米(bortezomib)是首個被批準臨床上用于治療B細胞淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤的泛素蛋白酶體抑制劑，2012年另一種泛素蛋白酶體抑制劑卡非佐米(carfilzomib)也被FDA批準用于多發(fā)性骨髓瘤的治療[14]，顯示出泛素蛋白酶體作為腫瘤有效治療靶點的重要性，USP22屬于去泛素化酶蛋白酶超家族，但目前還沒有針對USP22基因的分子靶向藥物。廖志偉等[15]在動物實驗中發(fā)現(xiàn),抑制USP22基因表達后，可使人鼻咽癌細胞株CNE-2裸鼠移植瘤生長受到抑制，裸鼠成瘤時間晚，瘤體生長明顯減緩，在人體中有無相似的作用值得進一步深入研究。以USP22為靶點的抗腫瘤藥物將成為研究熱點，USP22有望成為鼻咽癌治療的新靶點。

綜上所述，USP22作為癌死亡標簽中的一員，影響著腫瘤細胞的生長和增殖。目前已有越來越多的研究證實了USP22在多種惡性腫瘤細胞中高表達，且與疾病的進展和預(yù)后密切相關(guān)，這為日后開發(fā)以USP22為標靶的抗腫瘤藥物提供了理論基礎(chǔ)。USP22的在鼻咽癌組織中有過表達，USP22基因可能參與鼻咽癌的發(fā)生過程，USP22有望成為鼻咽癌的診斷與鑒別診斷、預(yù)后判斷指標和治療靶點。