李娟娟， 杜偉△， 郭偉蓮， 王光明

大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1放射科， 2病理科(云南大理 671000)

肝癌是世界上常見的惡性腫瘤之一，在我國已成為第2位的腫瘤致死性疾病[1]。外科手術(shù)切除、肝移植是肝癌患者最有效的治療手段，但大部分患者確診時(shí)已為中晚期，致使根治性手術(shù)切除率僅為20%[2]。因此，經(jīng)導(dǎo)管肝動(dòng)脈栓塞術(shù)(transcatheter hepatic artery embolization，TAE)已經(jīng)成為治療中晚期肝癌的首選方法[3]。在我國90%以上的肝癌發(fā)生于肝硬化基礎(chǔ)上，肝癌患者常需多次進(jìn)行TAE治療，但TAE對(duì)肝組織的損傷往往使原本脆弱的肝臟儲(chǔ)備功能進(jìn)一步受損，導(dǎo)致肝功能失代償，甚至肝衰竭。肝功能損傷的發(fā)生率在22.4%～66.7%之間，是TAE術(shù)后影響患者生存期的主要因素[4-5]，限制了TAE的廣泛應(yīng)用，因此，怎樣減輕甚至避免TAE術(shù)后對(duì)肝組織的損傷已經(jīng)成為影響患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferators-activated receptor-α，PPAR-α)作為配體依賴性的核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，高表達(dá)于肝臟，是一種肝細(xì)胞保護(hù)因子[6]。研究發(fā)現(xiàn)，PPAR-α參與氧化應(yīng)激、細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)。盡管PPAR-α是一種肝細(xì)胞保護(hù)因子，但在肝癌術(shù)后肝組織發(fā)生損傷的過程中PPAR-α和氧化應(yīng)激(OS)是如何改變的，目前國內(nèi)外很少有研究報(bào)道。2017年2月至2018年2月，本研究通過觀察肝癌TAE后肝組織中PPAR-α和OS的表達(dá)，旨在探討肝癌TAE術(shù)后PPAR-α和OS的改變與肝功能損傷間的作用機(jī)制，為臨床PPAR-α靶點(diǎn)治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 荷瘤兔2只(由東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院惠贈(zèng))，新西蘭大白兔35只(由大理大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心代購)，體重2.5～3.2 kg，雌雄不限，月齡4～5個(gè)月，營養(yǎng)狀況一致。

1.2 主要藥品及檢測(cè)試劑 3%巴比妥鈉，硫酸慶大霉素注射液，0.9%氯化鈉溶液，碘伏消毒液，購自茂名市消毒用品廠有限公司(廣東，中國)，PPAR-α鼠抗兔多克隆抗體，小鼠IgG免疫組化試劑盒SV001，購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司(武漢，中國)，兔[超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)]ELISA試劑盒、丙二醛(MDA)測(cè)試盒、PPAR-α ELISA試劑盒，購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司(上海，中國)。

1.3 肝癌動(dòng)物模型建立 實(shí)驗(yàn)兔于造模前12 h禁食，8 h禁飲，麻醉、固定于兔臺(tái)，手術(shù)區(qū)域備皮后常規(guī)消毒鋪巾。于劍突下沿腹部正中線逐層切開進(jìn)入腹腔暴露肝臟后，在棉簽與紗布幫助下用無齒鑷輕輕將肝左葉拉出，眼科剪刺破肝組織建立竇道，竇口直徑約1 mm，深約0.5 cm，將制備好的腫瘤顆粒用眼科鑷夾取填塞入竇道內(nèi)，按壓竇口，腹腔內(nèi)灑入4萬U慶大霉素，紗布?jí)浩却┐厅c(diǎn)止血3～5 min，無滲血后將肝臟放回腹腔內(nèi)，并按腹膜、肌肉、皮膚逐層縫合切口，碘伏消毒，查看生命體征存在，放回飼養(yǎng)房。術(shù)后肌內(nèi)注射4萬U慶大霉素，1次/d,連續(xù)3 d，預(yù)防感染，注意保溫[7]。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型分組及TAE術(shù) 造模后4周行CT檢查追蹤腫瘤生長情況，將建模成功的27只新西蘭大白兔VX2肝癌模型進(jìn)行隨機(jī)分組，對(duì)照組、造影組及TAE組各9只。TAE組用碘化油0.2 mL/只栓塞供血肝動(dòng)脈；造影組僅行肝動(dòng)脈插管造影不注入任何藥物;對(duì)照組不做任何處理。新西蘭大白兔全麻后固定于操作臺(tái)上，右腹股溝附近10 cm范圍內(nèi)備皮、消毒，用18G穿刺針穿刺進(jìn)入股動(dòng)脈后引入導(dǎo)絲，拔去穿刺針后引入4F導(dǎo)管鞘，經(jīng)導(dǎo)管鞘放入4F導(dǎo)管，通過導(dǎo)絲選入腹腔干，然后將3F微導(dǎo)管通過4F導(dǎo)管超選入肝總動(dòng)脈，造影明確腫瘤供血?jiǎng)用}，然后行超選擇性肝動(dòng)脈造影，TAE組用3F微導(dǎo)管推入0.2 mL碘化油后再用明膠海綿顆粒栓塞。TAE組術(shù)后10 h，處死各組實(shí)驗(yàn)兔并切取所需肝臟標(biāo)本。

1.5 PPAR-α和氧化應(yīng)激指標(biāo)(SOD、CAT、GSH-Px和 MDA)含量的測(cè)定及方法 造影和TAE治療后10 h，處死各組實(shí)驗(yàn)兔，立即取各組樣品放在0.9%氯化鈉溶液溶液中(0℃或以下)洗滌，在冰浴中制成不同濃度的組織勻漿，生化酶學(xué)法檢測(cè)肝組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)(SOD、CAT、GSH-Px和MDA)在不同實(shí)驗(yàn)組間癌旁肝組織中的活力或含量改變；免疫組化法檢測(cè)PPAR-α在不同組間肝組織中的表達(dá)情況，嚴(yán)格按試劑盒說明操作。

1.6 PPAR-α免疫組化染色方法 肝組織取材后石蠟包埋，切片厚度6 μm，放到載波片上脫蠟到水，用甲醇雙氧水處理，非免疫血清封閉，滴加稀釋的一抗(1∶2 000)4℃過夜，PBS沖洗3次，滴加聚合HRP標(biāo)記抗小鼠IgG 37℃孵育30 min，PBS沖洗3次，然后DAB顯色鏡檢。

1.7 PPAR-α陽性判斷標(biāo)準(zhǔn) PPAR-α陽性細(xì)胞反應(yīng)物主要分布于細(xì)胞核，染色由深到淺分別為棕褐色、棕黃色、黃色以及淺黃色等。采用Fromowitz的計(jì)分法評(píng)分。每張切片選5個(gè)高倍鏡視野計(jì)數(shù)。根據(jù)陽性細(xì)胞染色的深度以及細(xì)胞數(shù)進(jìn)行評(píng)分：(1)染色深度：無著色0分，淡黃色1分，黃棕色2分，棕褐色3分；(2)陽性細(xì)胞數(shù)量：<5%記0分，5%～24%記1分，25%～50%記2分，51%～75%記3分，75%以上記4分。以兩者之和作為判斷結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)如下：<2分記作陰性(-)，2～3分記作弱陽性(+)，4～5分記作陽性(++)，6～7記作強(qiáng)陽性(+++)。

2 結(jié)果

2.1 肝癌TAE后各組肝組織的HE染色 肝癌TAE術(shù)后肝組織HE染色顯示，與其他兩組相比，TAE組的大部分肝細(xì)胞胞漿淡紅，核深染、核固縮、核碎裂，部分形成空泡，周圍見中性粒及淋巴細(xì)胞浸潤。見圖1。

A：對(duì)照組；B：造影組；C：TAE組

2.2 肝癌TAE后肝組織中PPAR-α的表達(dá) PPAR-α表達(dá)于3組肝細(xì)胞的細(xì)胞核，呈現(xiàn)淡黃至棕褐色顆粒，著色程度不一，3組均見PPAR-α的陽性表達(dá)，見圖2。與對(duì)照組相比，造影組PPAR-α的表達(dá)有降低趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，TAE組與其他兩組相比，PPAR-α的表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

2.3 肝癌TAE后肝組織SOD、CAT、GSH-Px和MDA的活力或含量的比較 造影組與對(duì)照組相比，肝組織抗氧化指標(biāo)SOD、CAT和GSH-Px活力有降低趨勢(shì)，而過氧化產(chǎn)物MDA含量有升高趨勢(shì)，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；TAE組肝組織抗氧化指標(biāo)SOD、CAT和GSH-Px活力明顯低于造影組，而過氧化產(chǎn)物MDA含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

A：對(duì)照組；B：造影組；C：TAE組

組別nSODCATGSH-PxMDA(nmol/mgprot)對(duì)照組946.27± 2.693.12±0.68263.14±6.7419.15±2.25造影組945.56±2.133.09±0.56259.07±5.9020.33±1.69TAE組921.92±2.06?1.17±0.49?189.72±8.21?25.98±2.53?

*與造影組比較P<0.01

3 討論

研究表明，PPAR-α對(duì)組織和器官遭受的損傷具有保護(hù)作用，可通過多種途徑參與組織的抗損傷，維持其正常生理功能[8-9]。對(duì)于參與人體多種物質(zhì)代謝的肝組織，這種保護(hù)作用顯得更為重要，當(dāng)PPAR-α表達(dá)降低或者缺失時(shí)，肝細(xì)胞的損傷有進(jìn)一步加重的趨勢(shì)。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的研究發(fā)現(xiàn)[10]，使用PPAR-α拮抗劑GW6471可使細(xì)胞增殖所致的缺氧和血管生成保護(hù)作用下降；相反，使用PPAR-α激動(dòng)劑非諾貝特治療后，可降低炎性細(xì)胞浸潤、總蛋白濃度、血管密度、炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生[11]。研究顯示[12]，小鼠發(fā)生非酒精性脂肪肝時(shí)，其肝臟PPAR-α表達(dá)下調(diào)，表明肝臟損傷時(shí)可導(dǎo)致其降低。而使用激動(dòng)PPAR-α表達(dá)的藥物后，機(jī)體表現(xiàn)為肝臟脂肪變性和炎癥反應(yīng)減輕[13]。這些研究均表明，PPAR-α對(duì)維持機(jī)體的代謝平衡、抗氧化和抗炎損傷方面具有極其重要的作用。有研究報(bào)道[14]，PPAR-α活化可以通過細(xì)胞自噬減輕肝組織的炎癥反應(yīng)，能夠?qū)毙愿螕p傷產(chǎn)生保護(hù)作用，因此，肝癌TAE術(shù)后周圍的肝細(xì)胞缺血缺氧，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，引起PPAR-α的表達(dá)增加，從而發(fā)揮抗炎作用[15]，但是，PPAR-α對(duì)自噬的誘導(dǎo)抗炎作用具有劑量依賴性[14]，隨著肝癌疾病的進(jìn)展，細(xì)胞自噬受到抑制，抑制自噬可以加重肝臟損傷及肝組織的炎癥反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)PPAR-α對(duì)肝損傷原有的抗炎作用。

本研究通過免疫組化法檢測(cè)肝組織中PPAR-α的表達(dá)，結(jié)果顯示，肝組織中PPAR-α在造影術(shù)后表達(dá)有降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示造影劑不影響PPAR-α的表達(dá)。而肝癌介入栓塞術(shù)后PPAR-α顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，推測(cè)可能的機(jī)制為肝癌TAE術(shù)后，隨著疾病的進(jìn)展，肝細(xì)胞自噬受到抑制，逆轉(zhuǎn)PPAR-α對(duì)肝損傷原有的抗炎作用，使PPAR-α的表達(dá)降低，最終加重肝臟損傷及肝組織的炎癥反應(yīng)?；谶@一研究結(jié)果和上述文獻(xiàn)結(jié)論，筆者認(rèn)為通過使用PPAR-α的激動(dòng)劑可以作為降低介入術(shù)后肝功能損傷的靶點(diǎn)，具體結(jié)果有待進(jìn)一步研究。

肝臟作為機(jī)體內(nèi)最大的實(shí)質(zhì)器官，也是體內(nèi)最大的腺體，具有維持血糖穩(wěn)定，調(diào)節(jié)脂類代謝、蛋白質(zhì)合成及分解代謝、參與多種維生素和輔酶的代謝，參與多種激素的滅活等作用，對(duì)能量和氧的需求極大，使其對(duì)缺氧或缺血更為敏感，與其他細(xì)胞相比，肝細(xì)胞含有更多的抗氧化酶，增加了其抗氧化的能力，肝細(xì)胞中如果有ROS的過量產(chǎn)生，則立即引發(fā)氧化應(yīng)激[16]。氧化應(yīng)激既是導(dǎo)致肝功能障礙的原因，也是所有肝臟損傷的病理生理基礎(chǔ)[17]。氧化應(yīng)激是指機(jī)體遭受各種有害刺激(如栓塞、手術(shù)、創(chuàng)傷等)時(shí)，細(xì)胞中的ROS過度產(chǎn)生，使機(jī)體ROS的生成和清除平衡打破，自由基蓄積，抗氧化能力減弱，導(dǎo)致MDA堆積，引起細(xì)胞和組織損傷[18]。生理?xiàng)l件下，機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)主要為酶促抗氧化系統(tǒng)，包括SOD、CAT、GSH-Px等。其通過多種方式和途徑，清除體內(nèi)過多的自由基，維持機(jī)體抗氧化體系和ROS之間動(dòng)態(tài)平衡，保護(hù)組織細(xì)胞的各項(xiàng)生理功能正常發(fā)揮[19]。研究顯示[20]，在肝臟缺氧時(shí)，表現(xiàn)為抗氧化酶基因的表達(dá)下調(diào)。本研究通過對(duì)TAE術(shù)后肝組織中SOD、CAT和GSH-Px的活性以及MDA的含量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，TAE組與造影組相比，TAE組肝組織中SOD、CAT和GSH-Px的活性顯著降低，MDA含量顯著增加(P<0.01)，表明TAE術(shù)后肝組織缺血缺氧使脂質(zhì)過氧化程度加重，肝臟遭受了嚴(yán)重的氧化應(yīng)激。

綜上所述，肝癌TAE術(shù)中導(dǎo)管操作物理損傷、造影劑藥物化學(xué)毒性反應(yīng)、栓塞劑碘油堵塞血管以及多次進(jìn)行TAE術(shù)治療，引起癌旁肝組織中PPAR-α表達(dá)明顯降低，抗氧化指標(biāo)SOD、CAT和GSH-Px活力減低，過氧化產(chǎn)物MDA含量升高，導(dǎo)致活性氧在體內(nèi)蓄積，引起氧自由基釋放增多，炎癥因子表達(dá)增加，炎性細(xì)胞聚集、浸潤在肝組織中，損傷肝細(xì)胞，激活了一系列復(fù)雜的反應(yīng)以及持續(xù)產(chǎn)生內(nèi)源性的變化，導(dǎo)致肝細(xì)胞受損，肝功能下降。因此，本研究為今后肝癌TAE治療中肝功能損傷提供了新的治療靶點(diǎn)，我們可以通過預(yù)先使用PPAR-α激動(dòng)劑來預(yù)防和減輕TAE治療中的肝損傷，這具有重要的臨床價(jià)值。