張婷婷 周琢艷 李俊峰 劉文洪

浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053

解毒祛瘀滋陰方是范永升教授治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的臨床經(jīng)驗(yàn)方，本實(shí)驗(yàn)探討其對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)及其免疫功能的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及H22瘤株：昆明小鼠雄性24只，4～6周齡，體質(zhì)量18～22g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK（浙）2013-0184。H22瘤株購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 藥材與試劑：解毒祛瘀滋陰方由干地黃、白花蛇舌草、積雪草、薏苡仁各12g，鱉甲、青蒿、赤芍各10g，升麻20g，佛手8g，甘草6g等藥物組成，購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)門診部。5-氟尿嘧啶（5-FU）、小鼠白細(xì)胞介素-2（IL-2）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海源葉生物有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 模型制備及分組：實(shí)驗(yàn)用小鼠均按常規(guī)方法接種腫瘤細(xì)胞，取自行小鼠腹腔傳代7天的H22瘤株，無(wú)菌條件下抽取生長(zhǎng)良好的乳白色腹水液，以0.9%氯化鈉溶液1:1稀釋，經(jīng)0.2%臺(tái)盼藍(lán)染色后計(jì)算活細(xì)胞數(shù)＞95%，調(diào)整瘤細(xì)胞懸液為1×108個(gè)/ml瘤細(xì)胞，以每只0.2ml的劑量接種于小鼠右側(cè)腋窩下。接種次日將小鼠隨機(jī)分為3組：病理模型組、五氟尿嘧啶（陽(yáng)性藥）組、解毒祛瘀滋陰方（中藥）組，每組8只。

2.2 藥物制備及給藥方法：將解毒祛瘀滋陰方以10倍水煎煮2h，過(guò)濾；等體積水再次煎煮2h，過(guò)濾；合并濾液，并濃縮至含藥量1g/ml。根據(jù)人與小鼠藥物劑量換算公式算出小鼠每日給藥劑量。病理模型組予以生理鹽水20ml/kg，每日1次；陽(yáng)性藥組腹腔注射五氟尿嘧啶0.1ml/10g，每日1次；解毒祛瘀滋陰方（中藥）組予以18mg/kg濃縮液灌胃，每日1次。連續(xù)給藥10天。

2.3 體質(zhì)量及腫瘤生長(zhǎng)：于給藥前和停藥24h后以分析天平各測(cè)體質(zhì)量1次。末次給藥24h各組小鼠眼球采血后，以頸椎脫臼法處死，從腋部皮下完整剝離腫瘤組織，稱量腫瘤質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率（%）=（病理模型組平均瘤質(zhì)量-實(shí)驗(yàn)組平均瘤質(zhì)量）/病理模型組平均瘤質(zhì)量×100%。

2.4 免疫器官指數(shù)的測(cè)定：小鼠處死后快速剝離脾臟和胸腺并稱質(zhì)量，計(jì)算脾臟和胸腺指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量/動(dòng)物質(zhì)量。

2.5 小鼠血清IL-2、TNF-α含量的測(cè)定：給藥10d后，實(shí)體瘤小鼠摘眼球取血0.5～1.0ml，4℃3000r/min離心15min，取血清置于-20℃保存，IL-2、TNF-α試劑盒測(cè)定。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 解毒祛瘀滋陰方對(duì)H22荷瘤小鼠實(shí)體瘤生長(zhǎng)的影響：與病理模型組對(duì)比，解毒祛瘀滋陰方組給藥后體質(zhì)量明顯增高，瘤質(zhì)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與五氟尿嘧啶組對(duì)比，解毒祛瘀滋陰方組給藥后體質(zhì)量明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），瘤質(zhì)量無(wú)明顯差異。提示解毒祛瘀滋陰方組能抑制H22實(shí)體瘤的生長(zhǎng)。陽(yáng)性藥組與解毒祛瘀滋陰方組抑瘤率均達(dá)到30%以上，說(shuō)明五氟尿嘧啶與解毒祛瘀滋陰方對(duì)腫瘤生長(zhǎng)具有明顯抑制。詳見(jiàn)表1。

表1 解毒祛瘀滋陰方對(duì)H22實(shí)體瘤生長(zhǎng)的影響（±s）

注：與病理模型組比較，*P＜0.05；與陽(yáng)性藥組比較，ΔP＜0.05。

抑瘤率-45.91%76.28%組別病理模型組陽(yáng)性藥組中藥組例數(shù)8 8 8體質(zhì)量（g）給藥前27.78±0.96 26.85±0.95 27.82±1.57給藥后38.50±0.54 40.15±2.12 43.78±3.22*Δ瘤質(zhì)量（g）1.89±0.70 1.10±0.45 0.44±0.22*

3.2 解毒祛瘀滋陰方對(duì)H22荷瘤小鼠臟器指數(shù)的影響：與病理模型組對(duì)比，解毒祛瘀滋陰方組胸腺指數(shù)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與病理模型組對(duì)比，五氟尿嘧啶組胸腺指數(shù)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與五氟尿嘧啶組對(duì)比，解毒祛瘀滋陰方組胸腺指數(shù)顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。而脾臟指數(shù)病理模型組、解毒祛瘀滋陰方組與陽(yáng)性藥組均無(wú)明顯差異。詳見(jiàn)表2。

表2 H22荷瘤小鼠臟器指數(shù)（±s，%）

表2 H22荷瘤小鼠臟器指數(shù)（±s，%）

注：與病理模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與陽(yáng)性藥組比較，ΔΔP＜0.01。

脾臟指數(shù)63.20±7.22 80.40±13.84 77.42±13.10組別病理模型組陽(yáng)性藥組中藥組例數(shù)8 8 8胸腺指數(shù)22.03±2.14 10.16±3.10**32.82±6.54*ΔΔ

3.3 ELISA法測(cè)定細(xì)胞因子：與病理模型組和五氟尿嘧啶組對(duì)比，解毒祛瘀滋陰方組明顯提高血清中IL-2和TNF-α水平（P＜0.05）。五氟尿嘧啶組與病理模型組對(duì)比并無(wú)明顯差異。詳見(jiàn)表3。

表3 ELISA法測(cè)定細(xì)胞因子（±s，pg/ml）

表3 ELISA法測(cè)定細(xì)胞因子（±s，pg/ml）

注：與病理模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與陽(yáng)性藥組比較，ΔΔP＜0.01。

TNF-α 82.67±1.15 81.00±3.01 89.95±5.53**ΔΔ組別病理模型組陽(yáng)性藥組中藥組例數(shù)8 8 8 IL-2 30.59±4.00 28.60±4.02 41.11±8.12*ΔΔ

4 討論

前期研究表明解毒祛瘀滋陰方可以增強(qiáng)RAW264.7巨噬細(xì)胞吞噬功能，調(diào)節(jié)免疫功能[1]，故進(jìn)一步探討解毒祛瘀滋陰方的抗腫瘤功效。該方以干地黃清熱涼血益陰為君，白花蛇舌草、升麻清熱解毒消斑為臣，炙鱉甲補(bǔ)陰益腎退熱，赤芍、積雪草活血散血俱為佐藥，青蒿退熱，芳香體輕，開胃養(yǎng)脾，疏理少陽(yáng)氣機(jī)，炒薏苡仁、佛手片、生甘草調(diào)和脾胃，疏理氣機(jī)，調(diào)和諸藥為使。諸藥合用，共奏清熱解毒、活血化瘀、益腎養(yǎng)陰之功，為腫瘤的治療提供了新的方向。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，解毒祛瘀滋陰方對(duì)荷瘤小鼠的實(shí)體瘤生長(zhǎng)具有明顯抑制作用，并提高其血清細(xì)胞因子IL-2、TNF-α水平。IL-2是T細(xì)胞在體外生長(zhǎng)所必需的細(xì)胞因子，它可促進(jìn)已活化的T細(xì)胞增殖分化成熟為效應(yīng)遲發(fā)型超敏反應(yīng)T細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)，并可調(diào)節(jié)B細(xì)胞、NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的免疫功能[2]。腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞(TIL)往往對(duì)各種抗原沒(méi)有反應(yīng)，增殖活性低下，加入IL-2后可以逆轉(zhuǎn)這種無(wú)反應(yīng)狀態(tài)以證明其在腫瘤免疫過(guò)程中起到良好作用[3]。TNF-α是細(xì)菌脂多糖作用于單核巨噬細(xì)胞釋放的一種多肽類物質(zhì)，對(duì)腫瘤有直接溶解和抗腫瘤作用，還能增強(qiáng)炎癥部位單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)活性及NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用[4]。解毒祛瘀滋陰方組通過(guò)增強(qiáng)IL-2、TNF-α釋放，以達(dá)到調(diào)節(jié)T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫相關(guān)細(xì)胞功能，逆轉(zhuǎn)TIL的無(wú)反應(yīng)狀態(tài)，并作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，損傷內(nèi)皮細(xì)胞或?qū)е卵芄δ芪蓙y，使血管損傷和血栓形成，造成腫瘤組織的局部血流阻斷而發(fā)生出血、缺氧壞死，起到直接殺傷或抑制腫瘤作用。陽(yáng)性組藥物5-FU為抗代謝藥物，對(duì)胸腺骨髓有著明顯抑制作用，而解毒祛瘀滋陰方在抑制腫瘤生長(zhǎng)的同時(shí)，增強(qiáng)其胸腺指數(shù)，調(diào)節(jié)其免疫功能。其在抗腫瘤免疫中所起的重要作用，為腫瘤治療提供新的科研方向，并為臨床用藥提供新的思路與方法。但實(shí)驗(yàn)仍存在不足之處，動(dòng)物腫瘤模型存在個(gè)體差異會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，后續(xù)仍需繼續(xù)進(jìn)一步研究。