齊錦佩，楊夢姿，趙琳琳，張振輝，朱偉豪，翟仙敦

死亡時間(postmortem interval, PMI)推斷一直是司法鑒定的熱點和難點，隨著法醫(yī)昆蟲學研究的深入，嗜尸性昆蟲的生長發(fā)育規(guī)律可以為PMI的推斷提供重要的線索已成為共識[1]，但嗜尸性昆蟲的種屬鑒定是其廣泛應用的瓶頸。其中，雙翅目(diptera)與尸體關系最為密切，其分析研究和應用也最多，尤以麗蠅科和麻蠅科發(fā)揮重要作用[2-3]。由于麻蠅生長區(qū)域廣泛、種類繁多，高度相似的形態(tài)外觀使其僅從外觀上難以辨別，相對于麗蠅，麻蠅在尸體不同腐敗時期的活動規(guī)律不同，其鑒定更加困難[4-5]。因此，對法醫(yī)學工作者來說，蠅類種屬的明確鑒定是一項巨大的挑戰(zhàn)。本研究選擇用線粒體細胞色素C氧化酶輔酶I(COI) 基因對4種洛陽常見的嗜尸性麻蠅進行序列分析，以期有助于豐富嗜尸性蠅類的基因數(shù)據(jù)庫，為死亡時間的推斷提供基礎數(shù)據(jù)。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1樣本

1.1.1實物樣本采集與保存以新鮮豬肝為誘餌，捕蠅籠放置于河南科技大學開元校區(qū)樹林里，誘捕采集到棕尾別麻蠅、赤尾麻蠅、醬亞麻蠅、急鉤亞麻蠅共8只。分類標簽置于離心管密封，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2虛擬樣本來源虛擬樣本來自GenBank數(shù)據(jù)庫，檢索關鍵詞Sarcophaga，以中國地區(qū)、COI、動物基因、序列長度為500到18 000為限定條件，經篩選獲得與本課題組一致的4種麻蠅共90只，見表1。

表1 GenBank檢索數(shù)據(jù)匯總表

1.2方法

1.2.1樣本DNA提取采用本課題組已經建立的嗜尸性蠅類DNA提取方法[6]，用Chelex-蛋白酶K法提取腿部DNA后，置于-20 ℃冰箱中保存。

1.2.2PCR擴增采用線粒體COI基因通用引物進行PCR擴增。擴增總體系10 μL，內含2×TaKaRa?premix 5 μL，上/下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，DNA模板(含10～20 ng DNA) 1.2 μL，ddH2O補足體系。PCR熱循環(huán)參數(shù)經優(yōu)化后，采用95 ℃ 1 min；95 ℃ 1 min，45 ℃ 1.5 min，72 ℃ 1.5 min，共5次循環(huán)；95 ℃ 50 s，50 ℃ 1 min，72 ℃ 50 s，共35次循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.2.3電泳、Sanger測序及序列分析電泳條件：2%瓊脂糖凝膠，溴乙錠染色，120 V電壓，電泳30 min，采用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照電泳譜帶。PCR產物送上海濰捷基貿易有限公司測序，同時采取正反鏈雙向測序以保證序列的準確性。Chromas Version 1.62分析軟件查看所獲得的8個蠅類樣本基因序列，使用MEGA X軟件刪去首尾信號雜亂序列，在GenBank 中進行在線BLAST 搜索和比對，然后使用鄰近法(neighbor-joining,NJ)對序列進行分析，包括：堿基組成分析、計算進化分歧率和構建系統(tǒng)發(fā)育樹[7]。

2 結果

2.1基因組提取及測序結果本實驗獲得共8個蠅種樣本。PCR擴增片段長度在700 bp上下，經過軟件去除雜帶和引物后的核苷酸片段長度為648 bp。在線BLAST比對結果顯示，所有實驗樣本與GenBank中已知序列的相似度均>99%，與形態(tài)鑒定結果完全一致。見表2。

表2 8個麻蠅樣本COI基因序列在線BLAST比對結果

2.2堿基組成差異分析對本研究中98只麻蠅成蟲樣本的COI基因進行序列分析，結果顯示：保守位點526個，可變位點108個。其中簡約性信息位點101個，自裔位點7個。堿基平均組成為：A=30.1%，G=16.0%，C=16.7%，T=37.1%，A+T=67.2%，具有明顯的A+T傾向性。

2.3發(fā)育樹分析運用MEGA X軟件包對上述98只麻蠅樣本線粒體COI基因序列進行分析，以家蠅為外群，構建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，結果按照不同屬、種分別聚類，分子鑒定結果和形態(tài)學鑒定結果完全符合。麻蠅屬種群聚清晰，在麻蠅種的級別上，自上而下共形成鮮明的4個群聚，分別包括41只棕尾別麻蠅、9只赤尾麻蠅、4只急鉤亞麻蠅和44只醬亞麻蠅，支持率均為100%，效果好。

2.4種內及種間進化分歧經計算獲得棕尾別麻蠅、赤尾麻蠅、醬亞麻蠅、急鉤亞麻蠅共98只不同個體的遺傳距離，98只蠅種平均進化分歧率0.06，種間范圍0.06～0.10，種內范圍0～0.03種間差異和種內差異沒有交叉，見圖1。

3 討論

我國的嗜尸性麻蠅分布廣泛、種類較多，且其繁殖周期特殊、嗜尸習性獨特，因此在死亡時間推斷等方面表現(xiàn)出其蠅種優(yōu)越的法醫(yī)學價值[6]。

圖1 4種麻蠅種間差異和種內差異

本研究共獲得棕尾別麻蠅、赤尾麻蠅、醬亞麻蠅、急鉤亞麻蠅8個麻蠅，分子鑒定結果與形態(tài)鑒定結果一致。洛陽地區(qū)的4種嗜尸性麻蠅8條序列與來自GenBank數(shù)據(jù)庫我國不同地區(qū)的90個相應蠅種序列合并分析后發(fā)現(xiàn)，利用COI基因序列可以有效地將洛陽地區(qū)常見嗜尸性麻蠅類鑒定到種的水平。所獲基因序列通過BLAST在線比對顯示，本研究麻蠅樣本與GenBank中的相應蠅種已知序列相似度均>99%。對本研究8個蠅類個體mtDNA上COI基因序列進行分析，在麻蠅科的級別上形成4個種群聚，支持率均為100%，種間劃分清晰、效果好；4個蠅種的平均進化分歧率0.06，種間范圍0.06～0.10，種內范圍0～0.03，種間差異和種內差異沒有交叉。

Zhang C等應用COI基因短序列成功對麻蠅科屬種進行鑒定，取得較好的效果，本研究結果與其一致[8-9]。Jordaens等對麻蠅科蠅種的COI全序列進行鑒定分析，證實COI全序列雖具有較高的鑒別效力[10]，但多態(tài)性好的仍為COI的經典序列區(qū)域，本研究結果再次證實該區(qū)域的良好多態(tài)性。雖然有不少研究指出，同種不同地區(qū)個體的一些基因差異較大，提示可以利用該差異進行死亡地點的推測[11-12]。本研究共分析15個城市的樣本，結果顯示差異不大，即使樣本量較大的棕尾別麻蠅和醬亞麻蠅也無明顯差異，這提示COI基因序列對所涉及的4種麻蠅的不能區(qū)分其歸屬地。

總之，本實驗表明線粒體COI(648 bp)序列能很好地對洛陽地區(qū)常見的4種嗜尸性麻蠅種類進行分析鑒定，所獲得的基因序列同時也是嗜尸性蠅類分子鑒定基因庫的有益補充。