楊洪波 石 潔 葉 勇 李文成 鄧兆平

膀胱癌是最常見的惡性腫瘤之一，好發(fā)于50～60歲，每年有近74，000例新診斷的病例[1-3]。在中國，膀胱癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)中最常見的癌癥，排名第8位。經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)(TURBT)被認(rèn)為是治療膀胱癌的首選，但45%～80%的膀胱癌患者可能會出現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)和進(jìn)展，且患者再次就診時病灶多已擴(kuò)散，預(yù)后較差，其5年生存率較低[4-7]。膠原蛋白V型2鏈(Collagen type V alpha 2 chain，COL5A2)在免疫系統(tǒng)調(diào)控、血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮著重要作用，其參與了結(jié)直腸癌、乳腺瘤、骨肉瘤的進(jìn)展；COL5A2表達(dá)增加時，腫瘤細(xì)胞無限制増殖、血管生成速度加快，且相關(guān)細(xì)胞因子如VEGF、P53等均表達(dá)增高[8-10]。目前關(guān)于COL5A2表達(dá)與膀胱癌關(guān)系的研究較少，因此本研究擬探討COL5A2在膀胱癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2010年5月—2013年7月在洪湖市人民醫(yī)院泌尿外科行手術(shù)治療并經(jīng)病理證實(shí)的膀胱癌患者144例，年齡40～74歲，平均(57.5±17.8)歲，病程9個月～4年；其中上皮細(xì)胞癌104例、腺癌16例、鱗狀細(xì)胞癌24例。符合美國國家綜合癌癥網(wǎng)(National Compre-hensive Cancer Network，NCCN)公布的2017版《Bladder Cancer，Version 5.2017，NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology》中關(guān)于膀胱癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]。手術(shù)切除標(biāo)本后判定有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。同時取距膀胱癌組織2 cm以上的正常膀胱組織為癌旁組?；颊咦栽柑峁┱０螂捉M織及膀胱癌組織標(biāo)本，用作分析COL5A2、基因及蛋白的表達(dá)。納入標(biāo)準(zhǔn)：既往無精神障礙史，無心理疾患或精神疾病史；本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批，所有患者(或患者直系親屬)均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：肝、腎、心功能異常者，感染性疾病、甲狀腺疾病、入院前接受放化療治療的其他惡性腫瘤、膽汁淤積、自身免疫性疾??；嚴(yán)重高血壓、呼吸道疾病、周圍血管性疾病或栓塞性疾病者。

1.2 COL5A2 mRNA在膀胱及膀胱癌組織中表達(dá)的測定

TRIzol試劑提取膀胱、膀胱癌組織中總RNA，測定總RNA的濃度和質(zhì)量。然后使用COL5A2特異性反向引物逆轉(zhuǎn)錄總RNA(0.5 μg)以獲得cDNA(COL5A2正向引物：GTCGCCATGCAGGGTCCGAGGTATGCGACT；COL5A2反向引物：CTCGCTTCGACATTGCCTACGAG)。反應(yīng)體系為：正向引物10 μL、反向引物10 μL、RNA模版0.6 μL、超級酶混合物0.2 μL、2×μByr一步法RT-qPCR緩沖液5 μL、去RNA水3.4 μL。循環(huán)如下：95℃持續(xù)10 min，進(jìn)行40個循環(huán)，持續(xù)15 s，60℃。Fast Synergy Brands Green Master Mix法在ABI 7500實(shí)時qPCR上測定miR-20a、BCL-2的相對水平。以U6作為內(nèi)部對照，以2-ΔΔCt作為計算方法。

1.3 COL5A2在膀胱及膀胱癌組織中表達(dá)水平的測定

制作常規(guī)5 μm的正常膀胱組織及膀胱癌組織石蠟切片，免疫組化法測定COL5A2在正常膀胱及膀胱癌組織中的表達(dá)，高倍視野(400×)計數(shù)，無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，同時計數(shù)；>50%為(+++)，26%～50%為(++)，6%～25%為(+)，陽性細(xì)胞≤5%為(-)，(-)及(+)歸為不表達(dá)組或低表達(dá)組即為陰性，(++)及(+++)歸為高表達(dá)組即為陽性。

1.4 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 癌旁組、膀胱癌組中COL5A2 mRNA水平的表達(dá)

膀胱癌組COL5A2 mRNA表達(dá)水平為2.58±0.67，癌旁組為0.68±0.24；膀胱癌組COL5A2 mRNA表達(dá)水平高于癌旁組(P<0.05)(表1)。

表1 癌旁組、膀胱癌組中COL5A2蛋白水平的表達(dá)

2.2 癌旁組與膀胱癌組中COL5A2表達(dá)的比較

免疫組化法定性分析蛋白表達(dá)水平，COL5A2陽性表達(dá)為棕褐色，膀胱癌組COL5A2陽性率高于癌旁組(79.1%vs. 2.8%)(P<0.05)(圖1，表2)。

圖1 COL5A2在癌旁組、膀胱癌組的表達(dá)Figure 1 Expression of COL5A2 in the paracancerous and bladder cancer groupsNote：A.Expression of COL5A2 protein in the paracancerous group；B.Expression of COL5A2 protein in the bladder cancer group.

GroupNumber of casesCOL5A2Positive(%)Negative(%)Paracancerous group1444(2.8)140(97.2)Bladder cancer group144114(79.1)30(20.9)χ219.882P<0.001

2.3 COL5A2蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

COL5A2蛋白表達(dá)與年齡無關(guān)(P>0.05)；與TMN分期、病理學(xué)分級、腫瘤最大徑、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴血管間隙浸潤、復(fù)發(fā)有關(guān)(P<0.05)，且TMN分期越高、病理學(xué)分期越高、腫瘤最大徑≥5 cm、浸潤深度越深、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有淋巴血管間隙浸潤、有復(fù)發(fā)，COL5A2蛋白陽性表達(dá)率越高(表3)。

表3 COL5A2蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.4 COL5A2蛋白表達(dá)水平與膀胱癌患者預(yù)后分析

COL5A2陰性組3年生存率及生存期均明顯高于COL5A2陽性組(χ2=41.619、Z=15.652，P<0.001)(圖2，表4)。

表4 COL5A2蛋白表達(dá)水平與膀胱癌患者預(yù)后分析

圖2 COL5A2陽、陰組Kaplan-Meier生存曲線分析Figure 2 Survival curves of patients with the expression of COL5A2 in the positive and negative groups by Kaplan-Meier analysis

3 討論

COL5A2基因編碼46 kDa的核定位轉(zhuǎn)錄抑制蛋白，該蛋白在國內(nèi)外研究中已確定與惡性腫瘤進(jìn)展相關(guān)[12-13]。COL5A2最初在白血病發(fā)病機(jī)制中被發(fā)現(xiàn)，隨后發(fā)現(xiàn)，其水平的過表達(dá)與人類神經(jīng)細(xì)胞增殖和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)展有關(guān)[14]。近期研究發(fā)現(xiàn)，在人乳腺癌和家族性結(jié)直腸癌(Lynch綜合征)患者中鑒定出COL5A2上調(diào)。COL5A2蛋白能明顯抑制其下游細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄活性，還能穩(wěn)定的附著在動粒-微管上，導(dǎo)致有絲分裂期間紡錘體損傷進(jìn)而染色體分離受阻，細(xì)胞惡性病變[15]。

COL5A2可能參與了多種人類癌癥的病理過程。研究發(fā)現(xiàn)[16]COL5A2在結(jié)直腸癌中表達(dá)，但在正常結(jié)腸中不表達(dá)，這表明COL5A2與結(jié)直腸癌的發(fā)生有關(guān)；COL5A2在腺瘤來源的發(fā)育不良上皮細(xì)胞中明顯上調(diào)；通過微陣列研究結(jié)果顯示，與原位導(dǎo)管癌相比，浸潤性乳腺癌中COL5A2的表達(dá)增加[17]，這也與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)重塑有關(guān)，表明COL5A2與乳腺癌的腫瘤進(jìn)展有關(guān)，COL5A2在骨肉瘤細(xì)胞中上調(diào)，可能被認(rèn)為是骨肉瘤的診斷標(biāo)志物?？傊?，文獻(xiàn)綜述的結(jié)論證實(shí)，COL5A2與腫瘤發(fā)生和腫瘤進(jìn)展相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，膀胱癌組COL5A2 mRNA表達(dá)水平高于癌旁組，膀胱癌組COL5A2陽性率高于癌旁組，這與上述結(jié)論一致。而度表達(dá)COL5A2的肝癌細(xì)胞株增殖能力高于野生株。高表達(dá)COL5A2蛋白的腫瘤細(xì)胞黏附內(nèi)皮細(xì)胞的能力強(qiáng)[18]，而腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞緊密結(jié)，才能穿過細(xì)胞外基質(zhì)層，建立轉(zhuǎn)移灶。本研究結(jié)果提示，COL5A2蛋白表達(dá)與年齡相關(guān)性不明顯；與TMN分期、病理學(xué)分級、腫瘤最大徑、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴血管間隙浸潤、復(fù)發(fā)相關(guān)性明顯，且TMN分期越高、病理學(xué)分期越高、腫瘤最大徑≥5 cm、浸潤深度越深、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有淋巴血管間隙浸潤、有復(fù)發(fā)，COL5A2蛋白陽性表達(dá)率越高。這說明COL5A2具有促進(jìn)癌細(xì)胞分化與侵襲遷移能力的作用，與國內(nèi)外研究一致[19]。

近期研究發(fā)現(xiàn)[20]，COL5A2是結(jié)締組織的主要纖維蛋白，是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中最豐富的蛋白質(zhì)。COL5A2可能通過凝血、缺氧、頂端交界處、紫外線反應(yīng)，促進(jìn)癌細(xì)胞的進(jìn)展；COL5A2對細(xì)胞增殖發(fā)揮重要作用，并能強(qiáng)烈抑制細(xì)胞凋亡，COL5A2可促進(jìn)甲基化CpG結(jié)合蛋白MeCP2、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤結(jié)合蛋白2、抗凋亡蛋白等癌蛋白。此外COL5A2基因突變一般發(fā)生于腫瘤的早期，COL5A2基因突變后，處于高度活化狀態(tài)，且不受EGFR信號通路的調(diào)控，即使用EGFR拮抗劑阻斷了上游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，突變的COL5A2的仍可發(fā)揮其促腫瘤增殖作用，EGFR拮抗劑對COL5A2基因突變的惡性腫瘤患者不能發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究結(jié)果同時顯示，COL5A2陰性組3年生存率及生存期均明顯高于COL5A2陽性組，說明COL5A2低表達(dá)能明顯降低膀胱癌患者預(yù)后，與上述討論一致。

綜上所述，COL5A2在膀胱癌組織中表達(dá)量增加，其在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展過程中起促進(jìn)作用；COL5A2低表達(dá)的膀胱癌患者能獲得較好的預(yù)后。