鮑 鵬 ，余斯琦 ，蘇春玉 ，于東渤 ，朱長(zhǎng)軍 ，董智雄

（1.天津師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2.天津師范大學(xué) 天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387；3.天津師范大學(xué) 分子細(xì)胞系統(tǒng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387）

生物體中，蛋白質(zhì)是基因表達(dá)的產(chǎn)物，也是最終執(zhí)行生物功能的分子.核仁是真核細(xì)胞內(nèi)核糖體生物發(fā)生的場(chǎng)所，它通過控制核糖體的生物發(fā)生調(diào)控細(xì)胞的各項(xiàng)基本生命活動(dòng)[1-5].有研究發(fā)現(xiàn)，大量與核仁和核糖體生物發(fā)生途徑相關(guān)的蛋白在腫瘤中的表達(dá)水平升高，可用于腫瘤診斷、惡性程度判斷及預(yù)后等.如核仁蛋白NOP14在胰腺癌肝轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)上調(diào)，可能通過促進(jìn)腫瘤微血管形成導(dǎo)致胰腺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[6-7]；核仁蛋白EBP2在肺癌細(xì)胞系中高表達(dá)，且它的過表達(dá)能促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖[8]；核仁蛋白PES1在乳腺癌組織中高表達(dá)，它與乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)，可作為乳腺癌的生物標(biāo)記物[9-11].

常用于組織蛋白表達(dá)水平檢測(cè)的方法有Western blot、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA）、免疫熒光染色、免疫組織化學(xué)染色等.Western blot可以檢測(cè)樣品中是否存在目的蛋白的抗原、在組織中的含量及其抗原多肽鏈的相對(duì)分子質(zhì)量等，具有高效、簡(jiǎn)便、靈敏等特點(diǎn)，但在檢測(cè)過程中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)非特異性條帶、膜本底差、顯色不好等問題，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果.ELISA多用于定量分析，其靈敏度極高，可以定量檢測(cè)蛋白，直接讀出濃度，但如果抗體出現(xiàn)非特異性結(jié)合，則通過ELISA得到的數(shù)值可信度會(huì)降低，且該方法也無(wú)法檢測(cè)目的蛋白與特定蛋白質(zhì)的結(jié)合情況.免疫熒光染色和免疫組織化學(xué)染色中，目前常用的是冰凍切片免疫熒光染色、石蠟切片免疫組織化學(xué)染色和石蠟切片免疫熒光染色.冰凍切片免疫熒光染色最突出的優(yōu)點(diǎn)是能夠較完好地保存多種抗原的免疫活性，染色方法簡(jiǎn)單、快速、敏感，容易重復(fù)，結(jié)果容易判斷，但冰凍組織塊很小，難以長(zhǎng)期保存，因此無(wú)法用于回顧性分析研究[1].石蠟切片的優(yōu)點(diǎn)是組織結(jié)構(gòu)保存良好，在病理和回顧性研究中有較大的實(shí)用價(jià)值，能切連續(xù)薄片，組織結(jié)構(gòu)清晰，抗原定位準(zhǔn)確.石蠟切片雖優(yōu)點(diǎn)較多，但在制片過程中要經(jīng)過酒精、二甲苯等有機(jī)溶劑的處理，組織內(nèi)抗原活性失去較多.總之，組織蛋白表達(dá)的檢測(cè)方法很多，各有利弊，目前還沒有一個(gè)明確、統(tǒng)一的檢測(cè)方法.

本課題組通過檢索和分析Oncomine腫瘤基因數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，核仁蛋白R(shí)RP15與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其表達(dá)量在癌組織中上調(diào)了2.65倍.本研究制備了RRP15的特異性抗體，分別利用免疫組織化學(xué)染色和免疫熒光染色方法，檢測(cè)該蛋白在組織中的表達(dá)水平.以RRP15 mRNA的表達(dá)水平為參照，比較不同染色方法的優(yōu)劣性，從而為找到一種能夠快速、準(zhǔn)確定量檢測(cè)組織蛋白表達(dá)水平的方法提供參考.

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

1.1.1 材料

12例病例標(biāo)本購(gòu)置于武漢谷歌生物科技有限公司.

1.1.2 儀器

熒光共聚焦顯微鏡（Eclipse90i），日本Nikon公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國(guó)Bio-Rad公司.

1.1.3 試劑

特異性多克隆兔抗RRP15抗體，本實(shí)驗(yàn)室自制；辣根過氧化物酶（Horse radish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔抗體，美國(guó)Immuno公司；Trizol試劑盒，美國(guó)Invitrogen公司；免疫組化試劑盒，丹港生物科技有限公司；Ultra SYBR Mixture，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司.

1.2 方法

1.2.1 Real-time PCR檢測(cè)RRP15 mRNA的表達(dá)

使用Trizol試劑盒（操作參照說明書）提取腫瘤組織和正常組織的總RNA.取2 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA.PCR總反應(yīng)體系為20 μL，包括oligo dT 1 μL、dNTP 4 μL、5×buffer 4 μL、反轉(zhuǎn)錄酶 1 μL，加高壓水補(bǔ)足至20 μL，將上述樣品混勻，利用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增.反應(yīng)參數(shù)：25 ℃ 10 min；42 ℃ 1 h；95 ℃ 5 min；4℃保溫.合成cDNA后進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測(cè)RRP15 mRNA的表達(dá)水平，以β-actin為內(nèi)參.PCR引物包括：RRP15 上游引物（5′-GGTAACTGGAGCCGTAG-3′）、下游引物（5′-GGACTTTAGCCATAGCAT-3′）；β-actin 上游引物（5′-TCGTGCGTGACATTAAGGAG-3′）、β-actin下游引物（5′-ATGCCAGGGTACATGGTGGT-3′）.PCR總反應(yīng)體系為20 μL，包括2×Ultra SYBR Mixture PCR緩沖液 10 μL、10 μmol/L 的上、 下游引物各 1 μL、cDNA模板1.5 μL，超純水補(bǔ)足至20 μL.反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃反變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán).溶解曲線分析：95℃15s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s.

1.2.2 免疫組織熒光染色法

石蠟切片免疫組織熒光染色步驟如下：（1）切片常規(guī)脫蠟至水；（2）將切片放入檸檬酸鈉緩沖液中，微波爐低火加熱 15 min，用 PBS 沖洗一次，5 min；（3）加入500 μL 封閉液，37 ℃孵育 20 min；（4）滴加稀釋的一抗工作液兔抗RRP15，37℃孵育2 h，用PBS沖洗3次；（5） 滴加 500 μL第二抗體，37℃濕盒孵育 1 h，用PBS 沖洗 3次；（6）滴加 500 μL 的 DAPI，37℃濕盒孵育5 min，用PBS洗3次，封片.

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色法

石蠟切片免疫組織化學(xué)染色步驟如下：（1）切片常規(guī)脫蠟至水；（2）將切片放入檸檬酸鈉緩沖液中，中火煮沸8 min，停火8 min，中低火煮7 min，用PBS洗一次；（3）將切片放入體積分?jǐn)?shù)為3%的H2O2中，37℃避光孵育 25 min，PBS洗 3次；（4） 加入 500 μL 封閉液，37℃孵育10 min；（5）滴加稀釋的一抗工作液兔抗RRP15，4℃過夜；（6）PBS洗 3次，滴加 500 μL 兔抗生物素化二抗，37℃濕盒孵育10 min，PBS沖洗3次；（7）滴加500 μL HRP標(biāo)記鏈親和素，37℃濕盒孵育10 min，PBS沖洗 3次；（8）滴加 400μL 新鮮配制的DAB顯色液作用7 min，水洗10 min，蘇木精復(fù)染1 min，用流水沖洗返藍(lán)，分化30 s，流水沖洗5 min，伊紅染色1 min，流水沖洗5 min，梯度乙醇脫水，浸入二甲苯，自然晾干后，中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察.

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，等級(jí)資料采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P＜0.05時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果與分析

2.1 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析RRP15蛋白在結(jié)腸癌中的表達(dá)

利用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析RRP15蛋白在多種癌癥中的表達(dá)情況，結(jié)果如圖1所示.由圖1可以看出，相對(duì)于正常結(jié)腸組織，RRP15蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)顯著升高，其表達(dá)量是正常組織中的2.65倍.

圖1 Oncomine數(shù)據(jù)顯示RRP15在結(jié)腸癌中高表達(dá)Fig.1 High expression of RRP15 in colon cancer showed by oncomine data

2.2 Real-time PCR檢測(cè)RRP15在結(jié)腸癌中的表達(dá)

從12例結(jié)腸癌病人的癌組織及相應(yīng)的癌旁正常組織中選取RRP15為目的蛋白，利用Trizol法提取組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA，進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè)，定量結(jié)果如圖2所示.由圖2（a）可以看出，在 12例病人中，1號(hào)、2號(hào)、5～8號(hào)、10～12號(hào)病例的結(jié)腸癌組織中，RRP15 mRNA的水平明顯高于癌旁組織，3號(hào)、4號(hào)、9號(hào)病例中的表達(dá)有不同程度的下調(diào).由圖2（b）可以看出，結(jié)腸癌組織中RRP15的表達(dá)量為癌旁組織的1.88倍.

圖2 RRP15 mRNA在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)Fig.2 RRP15 mRNA expression in colon cancer tissues

2.3 免疫熒光染色法檢測(cè)RRP15在結(jié)腸癌中的表達(dá)

制備12例結(jié)腸癌病人的癌組織及癌旁組織的石蠟切片，進(jìn)行免疫熒光染色，在熒光顯微鏡下以相同曝光時(shí)間進(jìn)行圖像采集，之后用Image Pro Plus統(tǒng)計(jì)其熒光強(qiáng)度，結(jié)果如圖3所示.由圖3（a）和圖3（b）可以看出，在12例結(jié)腸癌病人中，1號(hào)、2號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、8號(hào)、10號(hào)、11號(hào)、12號(hào)結(jié)腸癌組織中RRP15的熒光強(qiáng)度明顯高于癌旁組織，3號(hào)、4號(hào)、5號(hào)、9號(hào)結(jié)腸癌組織中的熒光強(qiáng)度則弱于癌旁組織，這與Real-time PCR的結(jié)果基本一致.綜合所有病例的結(jié)果可知，RRP15在結(jié)腸癌組織中的熒光強(qiáng)度是癌旁組織的1.29倍，如圖3（c）所示.

2.4 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)RRP15在結(jié)腸癌中的表達(dá)

利用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)12例結(jié)腸癌病人的癌組織及癌旁組織中RRP15的表達(dá)，結(jié)果如圖4所示.

圖3 免疫熒光染色檢測(cè)RRP15在結(jié)腸癌中的表達(dá)Fig.3 Detection of RRP15 expression in colon cancer tissues using immunofluorescence staining

圖4 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)RRP15在結(jié)腸癌中的表達(dá)Fig.4 Detection of RRP15 expression in colon cancer tissues using immunohistochemical staining

由圖4可以看出，在12例患者中，1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、5號(hào)、6號(hào)、8號(hào)、9號(hào)、10號(hào)、12號(hào)為陽(yáng)性，4號(hào)、7號(hào)、11號(hào)為陰性.該種檢測(cè)方法中，3號(hào)、7號(hào)、9號(hào)、11號(hào)的檢測(cè)結(jié)果均與Real-time PCR的檢測(cè)結(jié)果不一致.

3 討論與結(jié)論

為了尋找一種簡(jiǎn)便快捷、可靠的組織蛋白表達(dá)水平檢測(cè)方法，本研究以結(jié)腸癌患者腫瘤組織和正常組織中RRP15 mRNA的表達(dá)水平作為參照，比較免疫熒光染色法和免疫組織化學(xué)染色在檢測(cè)組織蛋白表達(dá)水平上的優(yōu)劣.結(jié)果顯示，石蠟切片免疫組織化學(xué)染色法和石蠟切片免疫熒光染色法都能對(duì)癌組織中蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，但后者準(zhǔn)確率更高，而且通過統(tǒng)計(jì)染色后的熒光強(qiáng)度，可將蛋白水平進(jìn)行量化，更直觀地反映出表達(dá)情況.

在腫瘤的臨床檢測(cè)與治療過程中，多種蛋白的表達(dá)水平與患者的疾病惡化程度判斷、臨床治療手段的選擇及預(yù)后等直接相關(guān).如NGAL蛋白與免疫炎癥反應(yīng)相關(guān)，當(dāng)炎癥或腫瘤發(fā)生時(shí)組織內(nèi)的NGAL迅速升高，被認(rèn)定為評(píng)價(jià)因炎癥或腫瘤形成而導(dǎo)致內(nèi)皮損傷嚴(yán)重程度的重要標(biāo)志物[12-13].Survivin蛋白在多種泌尿系腫瘤中有表達(dá)，其高表達(dá)往往預(yù)示患者預(yù)后不良以及較高的復(fù)發(fā)率[14].由此可見，這些與癌癥發(fā)生發(fā)展、預(yù)后相關(guān)的蛋白在組織中精確的定量檢測(cè)至關(guān)重要.免疫熒光染色法能夠?qū)M織中的目的蛋白進(jìn)行熒光標(biāo)記，通過激光共聚焦顯微鏡對(duì)熒光標(biāo)記的組織標(biāo)本進(jìn)行共聚焦熒光定量分析，或者通過采集圖像信息統(tǒng)計(jì)其熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析.而免疫組織化學(xué)染色法只能進(jìn)行半定量的分析研究，而且其結(jié)果判斷主觀性較強(qiáng)，因此免疫組化法難以對(duì)某一蛋白進(jìn)行精確的定量分析.

除此之外，石蠟切片免疫熒光雙重染色法既有冰凍切片免疫熒光染色抗原特異性高、敏感性強(qiáng)、能同時(shí)顯示表達(dá)于同一部位的2種抗原的特點(diǎn)，又具有石蠟切片免疫組化染色組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰、抗原定位準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，這對(duì)于某些癌癥中需要精確檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)水平具有重要臨床意義.而免疫組化方法雖然具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、方法簡(jiǎn)單易行、圖像直觀、結(jié)果便于評(píng)價(jià)等優(yōu)點(diǎn)，但卻有很大的局限，例如一次只能檢測(cè)一個(gè)抗原、用多底物顯色系統(tǒng)標(biāo)記后結(jié)果不容易區(qū)分、特別是表達(dá)在相同位置的2個(gè)抗原容易出現(xiàn)重疊因此結(jié)果不好判斷等.該方法也會(huì)受到分辨率的影響，在明場(chǎng)下，底物顏色和切片厚度都能影響到最終結(jié)果.另外，由于顯色底物是酶促反應(yīng)，很容易出現(xiàn)底物飽和的現(xiàn)象，因而限制了半定量分析[15].

綜上所述，免疫熒光染色檢測(cè)法是檢測(cè)組織中蛋白表達(dá)水平的首選方法，免疫組化染色可作為一種輔助方法.對(duì)于某些組織只需要檢測(cè)目的蛋白表達(dá)的有無(wú)或者表達(dá)的高低可以選擇方法更加簡(jiǎn)便快捷的免疫組化，但對(duì)于需要準(zhǔn)確定量分析蛋白表達(dá)水平，或者探究蛋白表達(dá)水平與某種疾病之間的關(guān)系，免疫熒光染色是必不可少的檢測(cè)手段.