陳燕瓊+陳俊暉+林夏斌+漆子鈺+江鳴濤+彭東輝

摘要： 以巴西野牡丹（Tibouchina semidecandra）花粉為材料，篩選花粉活力測定的最佳方法，同時探討了光照對花粉萌發(fā)的影響；通過熒光顯微觀察不同授粉時長的花柱。結(jié)果表明：本試驗中最適宜巴西野牡丹花粉生活力測定的染色方法為聯(lián)苯胺染色法；與染色法相比，離體培養(yǎng)基法測定花粉生活力更可靠；適合的最佳萌發(fā)培養(yǎng)基為：蔗糖200 g/L+硼酸200 mg/L+CaCl2 50 mg/L。光照對花粉萌發(fā)影響顯著。熒光顯微觀察授粉3 h后花粉就已萌發(fā)，授粉12 h就有少數(shù)花粉管（<20根）達到花柱底部，授粉48 h大部分的花粉管（>80%）達到花柱底部。花粉管生長過程存在胼胝質(zhì)阻擋、花粉管尖端膨大、花粉管纏繞等異?，F(xiàn)象，從而不能通過柱頭完成受精作用，表現(xiàn)出典型的配子體型自交不親和性。

關(guān)鍵詞： 巴西野牡丹；花粉；萌發(fā)；染色法；自交不親和性

中圖分類號： S685.110.3 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）03-0230-04

巴西野牡丹（Tibouchina semidecandra）是野牡丹科（Melastomaceae）蒂姆花屬（Tibouchina）植物，株高0.5～1.5 m，原產(chǎn)于巴西低海拔山區(qū)及平地，在無霜地區(qū)均能生長良好，并且一年四季開花不斷。巴西野牡丹性喜高溫，極耐旱和耐寒，花期長，在廣州地區(qū)，盛花期為10月份到次年的6月份[1]。巴西野牡丹植株株型緊湊美觀，花開為少見的濃艷紫色，極為美觀，可作為優(yōu)良的灌木及盆花植物[2]。從引進至今園林應(yīng)用日漸廣泛，深受人們的喜愛。將巴西野牡丹花期長、花大色艷的優(yōu)良性狀與本地野牡丹科植物性狀相結(jié)合，是選育新品種的新思路。而花粉生活力的大小直接影響授粉的成敗，本試驗比較了4種花粉生活力測定方法間的差異，以期選擇適合巴西野牡丹花粉生活力快速測定的方法。對其花粉活力的測定可為相關(guān)的野牡丹科植物的雜交育種工作提供理論依據(jù)。并采用熒光測定法開展了不同時段花粉在柱頭上萌發(fā)特性的研究，旨在了解其花粉活力以及導(dǎo)致其結(jié)實率低的原因，為今后開展花粉活力測定以及克服授粉成功率低的問題提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

巴西野牡丹花粉于2014年11月14日采自福建農(nóng)林大學(xué)中華名特優(yōu)植物園。隨機選取3株長勢健壯的巴西野牡丹實生苗，在花朵開放前1 d對花朵進行套袋，第2天將剛開放套袋的花朵剪下取回實驗室，用解剖針小心將雄蕊解剖并擠出花粉，然后將花粉均勻混合并收集在離心管中保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 3種花粉生活力測定染色法的比較 花粉生活力測定采用染色法：（1）醋酸洋紅染色法[3]。被染成紅色為有活力的花粉，無顏色的為無活力的花粉。（2）聯(lián)苯胺染色法[4]。被染成紅色的為有活力的花粉，無顏色的為無活力的花粉。（3）亞甲基藍染色法[5]。被染成藍色的為有活力的花粉，無顏色的為無活力的花粉。染色結(jié)果以離體培養(yǎng)法為參照。計算公式：花粉生活力=被染紅的花粉數(shù)量/觀察花粉數(shù)量×100%。

1.2.2 離體培養(yǎng)法 采用液體培養(yǎng)基[6]進行巴西野牡丹花粉的離體萌發(fā)試驗，采用L9（34）正交表，研究蔗糖、硼酸和CaCl2不同水平對巴西野牡丹花粉萌發(fā)的影響，按表1配制9種培養(yǎng)液。用解剖針挑取少量花粉撒入裝有培養(yǎng)液的離心管中搖勻，使花粉與培養(yǎng)液充分混合，培養(yǎng)條件為（30±2） ℃，全光照培養(yǎng)。每組觀察5個視野，每個視野統(tǒng)計大于100?；ǚ??；ǚ酃荛L度大于花粉直徑的花粉視為已萌發(fā)花粉。計算公式：花粉萌發(fā)率=已萌發(fā)花粉數(shù)/觀察花粉總數(shù)×100%。

1.2.3 光照對花粉萌發(fā)的影響 采用正交設(shè)計第5組的培養(yǎng)液，用解剖針挑取少量花粉撒入裝有培養(yǎng)液的離心管中搖勻，使花粉與培養(yǎng)液充分混合，分別在黑暗或全光照、溫度均為（30±2）℃條件下培養(yǎng)花粉2 h，計算花粉萌發(fā)率。操作步驟及統(tǒng)計方法同“1.2.2”節(jié)。

1.2.4 自交授粉后花粉管生長狀況觀察 對巴西野牡丹進行自交，授粉方法為于開花前1 d對巴西野牡丹花朵進行去雄套袋，待柱頭分泌大量黏液時選擇于當天09：00—12：00進行常規(guī)人工授粉。試驗前觀察記錄巴西野牡丹單花花期，花開放至第10天花柱才脫落。因此依次采集授粉后3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、6 d、10 d的柱頭，每次采集3朵。在Ureshino等的方法[7]上進行改良，將采集后的柱頭用FAA固定液固定24 h，取出后用蒸餾水沖洗3次，轉(zhuǎn)移至裝有70%乙醇的離心管4 ℃條件保存待用，染色前將柱頭取出，蒸餾水沖洗后，用3 mol/L的NaOH溶液45 ℃水浴解離3 h，蒸餾水沖洗5次，再用0.1%的苯胺藍（0.1 mol/L K3PO4·7H2O 緩沖液）50 ℃水浴染色3 h，壓片后使用CI-L型熒光顯微鏡（尼康中國股份有限公司）在紫外光源下觀察柱頭內(nèi)部花粉管生長情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0軟件進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉生活力測定方法比較

由表2可知，醋酸洋紅染色值最高，染色效果明顯，易區(qū)分。聯(lián)苯胺染色法的染色效果最明顯，被染色的花粉整體為紅色，而無活力的花粉呈淺黃色近無色。亞甲基藍染色效果明顯，但是不易區(qū)分（圖1）。經(jīng)過單因素方差分析得不同染色方法對巴西野牡丹花粉萌發(fā)影響顯著[F=13.311>F0.05（1，8）=532]。

2.2 離體培養(yǎng)法

在不同培養(yǎng)條件下，巴西野牡丹花粉的處理7萌發(fā)率最高，平均39.44%，處理3萌發(fā)率最低，平均18.31%（表3）。極差分析結(jié)果表明，蔗糖是影響花粉萌發(fā)率的主要因素，在一定范圍內(nèi)，蔗糖的濃度越高花粉萌發(fā)率也就越高。其次是硼酸。最適宜巴西野牡丹花粉萌發(fā)的組合為蔗糖200 g/L+硼酸200 mg/L+CaCl2 50 mg/L。

方差分析結(jié)果表明：蔗糖對巴西野牡丹花粉萌發(fā)影響顯著[F蔗糖=26.782>F0.05（2，8）=19.0]。進一步對不同處理進行多重比較結(jié)果（表4）表明，巴西野牡丹花粉隨著蔗糖濃度的增加，花粉萌發(fā)率也相應(yīng)提高。200 g/L 的蔗糖濃度與50 g/L有顯著性差異，50 g/L和100 g/L差異不顯著，因此蔗糖濃度的提高有利于花粉萌發(fā)。

2.3 光照對花粉萌發(fā)率的影響

在黑暗條件下巴西野牡丹花粉的萌發(fā)率為20.79%，光照條件下為29.05%。經(jīng)過單因素方差分析結(jié)果表明，在光照和黑暗條件下培養(yǎng)對巴西野牡丹花粉萌發(fā)影響差異顯著[F=7.163>F0.05（1，8）=5.32]，光照有利于巴西野牡丹花粉的萌發(fā)。

2.4 自交授粉后花粉管生長狀況觀察

巴西野牡丹自交不同授粉時長花粉管生長情況見圖2。3 h后即有大量花粉開始萌發(fā)并伸入柱頭；6 h后柱頭上的花粉伸入柱頭達柱頭總長的1/6處，柱頭頂部開始出現(xiàn)大量胼胝質(zhì)，花柱內(nèi)未見明顯胼胝質(zhì)產(chǎn)生；12 h后柱頭頂部仍有較明顯的胼胝質(zhì)沉淀，大部分的花粉管達到花柱的1/4處，極少數(shù)（< 20根）達到花柱的底部，發(fā)現(xiàn)底部有大量胼胝質(zhì)出現(xiàn)，發(fā)出明亮光點；24 h后花柱頂部胼胝質(zhì)較不明顯，大部分花粉管達到花柱1/2處，花粉管間斷產(chǎn)生胼胝質(zhì)沉淀；48 h后柱頭頂部花粉管纏繞成束狀，同時花粉管達到巴西野牡丹花柱底部。觀察授粉后6、10 d 的花粉管在柱頭內(nèi)的生長狀況，巴西野牡丹的花粉能在花柱內(nèi)正常生長，但是隨著花粉管的伸長，由于出現(xiàn)胼胝質(zhì)、花粉尖端膨大以及花粉管纏繞等現(xiàn)象（圖3），觀察到穿過柱頭底部進入子房的花粉管數(shù)量均為0。

3 討論與結(jié)論

3.1 花粉生活力測定

王欽麗等[8]提出用不同的表述方法表述花粉生活力，而本次試驗做的只是花粉可染性的試驗，并不能反映花粉本身的可育性和受精力。醋酸洋紅染色法與聯(lián)苯胺染色法的基本原理都是依靠花粉中特定的酶與染料發(fā)生作用而染色；但是即使花粉失去活力，2種酶的活性仍然存在，所以最終的測定結(jié)果偏高。亞甲基藍染色法的原理是根據(jù)花粉粒的胞質(zhì)存在的有無判斷花粉生活力，但這種方法亦能使衰老和死亡的花粉著色，使花粉生活力的測定值偏高，并且有胞質(zhì)的花粉并不一定具有受精的能力[9]。3種染色方法的測定值均偏高，但是聯(lián)苯胺染色法的染色時間最短，效果最明顯，也容易區(qū)分，在本試驗中是最適宜巴西野牡丹花粉生活力測定的染色方法。花粉生活力測定的方法還有許多，比如TTC染色法、MTT染色法等，要找到更為適宜的測定方法還需要做進一步的試驗研究。

本試驗中對于巴西野牡丹花粉生活力的測定，最佳的染色方法為聯(lián)苯胺染色法；相較于染色法，離體培養(yǎng)基法測定的花粉生活力更可靠，最佳萌發(fā)培養(yǎng)基為：蔗糖200 g/L+硼酸200 mg/L+CaCl2 50 mg/L。

3.2 光照對巴西野牡丹花粉萌發(fā)的影響

光照對不同種類植物的花粉萌發(fā)影響結(jié)果不同。有研究表明，黑暗條件會抑制紫荊的花粉萌發(fā)[10]。馬尾松花粉在黑暗下的萌發(fā)率大于光照下的萌發(fā)率，但是差異并未達到顯著水平[11]。野牡丹科的另一種植物野牡丹的紫紅色雄蕊中的花粉在光照條件下的萌發(fā)率大于黑暗條件下，黃色雄蕊中的花粉則相反，但兩者均未達到顯著差異，表明遮光處理對野牡丹花粉萌發(fā)無明顯影響[12]。本試驗中巴西野牡丹光照條件下萌發(fā)率大于黑暗條件下，且達到顯著差異，表明光照對巴西野牡丹花粉萌發(fā)影響顯著。這或許與巴西野牡丹的喜光的生態(tài)習(xí)性有關(guān)。

3.3 自交授粉后花粉管生長狀況

被子植物的有性繁殖成功與否有賴于傳粉（pollination）與受精（fertilization）過程中一系列過程的正常完成：從花粉粒的附著（adhesion）、水合（hydration）、花粉管的萌發(fā)（germination）、生長到完成雙受精（double fertilization），再到合子、胚乳的發(fā)育及種子的成熟等[13]。而在這樣的一個過程中一般依據(jù)能否完成正常的雙受精作用并發(fā)育成雜合子，而將生殖障礙劃分為合子前障礙（pre-zygotic barrier，也稱受精前障礙）和合子后障礙（post-zygotic barrier），后者也稱受精后障礙（post-fertilization barrier）[14]。巴西野牡丹的花粉可在柱頭上正常萌發(fā)，且花粉管可伸入柱頭達到深處，這一過程與百合屬植物類似。自交不親和植物百合屬為配子體不親和型，柱頭對不親和花粉沒有抑制作用，識別和拒絕的過程都發(fā)生在花柱中，使得花粉管未能達到花柱最底部伸入子房，完成受精作用。依據(jù)巴西野牡丹花粉管生長特性，認為它是一個自交不親和性種類，其自交不親和性表現(xiàn)為花粉萌發(fā)后穿過柱頭，在花柱的底部附近花粉管被抑制而停止生長。初步推斷巴西野牡丹授粉存在受精前障礙，且屬于配子體型自交不親和性植物。

參考文獻：

[1]李 欣. 繁花似錦的巴西野牡丹[N]. 中國花卉報，2012-06-14.

[2]林秋金，林秀香，蘇金強，等. 16種野牡丹科植物觀賞性及適應(yīng)性綜合評價[J]. 西南林學(xué)院學(xué)報，2010，30（5）：33-37.

[3]劉絢霞. 醋酸洋紅染色法測定油菜花粉的生活力[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，1998（1）：23-24.

[4]左丹丹，明 君，劉 春，等.植物花粉生活力檢測技術(shù)進展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（16）：4742-4745.

[5]楊發(fā)君，張 妍，張 建，等.防風花粉活力測定方法的比較及柱頭可授性的研究[J]. 人參研究，2010（2）：22-25.

[6]胡適宜.植物學(xué)實驗方法（一）：花粉生活力的測定[J]. 植物學(xué)通報，1993，10（2）：60-62.

[7] Ureshino K，Kawai M，Miyazima I. Factors of inter-sectional unilateral cross incompatibility between several evergreen azalea species and Rhododendron japonicum f. flavum [J]. Journal of the Japanese Society for Horticulture Science，2000，36：261-265.

[8]王欽麗，盧龍斗，吳小琴，等.花粉的保存及其生活力測定 [J]. 植物學(xué)通報，2002，19（3）：365-373.

[9]張 妍，楊發(fā)君，田義新. 穿龍薯蕷花粉活力及柱頭可授性測定方法研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（5）：2344-2346.

[10]徐 華，聶丹，曹利民，等. H2O2在光/暗調(diào)節(jié)的花粉萌發(fā)中的作用[J]. 贛南師范學(xué)院學(xué)報，2008（6）：61-63.

[11]徐 進，陳天華，王章榮. 不同貯藏方法及光照對馬尾松花粉活力的影響[J]. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，1998，22（3）：71-74.

[12]江鳴濤，吳沙沙，卓孝康，等. 野牡丹花粉生活力與貯藏特性研究[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（17）：42-46.

[13]McClure B A，F(xiàn)ranklin-Tong V. Gametophytic self-incompatibility：understanding the cellular mechanisms involved in “self” pollen tube inhibition[J]. Planta，2006，224（2）：233-245.

[14]Wilcock C，Neiland R. Pollination failure in plants：why it happens and when it matters[J]. Trends in Plant Science，2002，7（6）：270-277.