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(濟(jì)南大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 山東濟(jì)南250022)

據(jù)生物多樣性研究統(tǒng)計(jì)，地球上的微生物總數(shù)遠(yuǎn)大于動植物總數(shù)之和，達(dá)300萬種，但是已被研究發(fā)現(xiàn)的還不到1/10。此外，在已發(fā)現(xiàn)的微生物中，只有不到1%的種類被利用[1]，這些尚未開發(fā)的微生物資源有待于進(jìn)一步挖掘，尤其是特殊生境微生物資源亟待開發(fā)。 特殊生境是指那些在結(jié)構(gòu)與功能上具有明顯的特殊性或異質(zhì)性的生態(tài)環(huán)境， 其生態(tài)元的數(shù)量或品質(zhì)具有明顯差異[2]。 分布在極地冰川、火山口、海洋、鹽堿地等生境的微生物統(tǒng)稱為特殊生境微生物。特殊生境的微生物具有在高溫、高寒、高壓、高鹽堿等極端環(huán)境中生存的優(yōu)勢，其抗逆基因及其代謝產(chǎn)物具有重要的研究價(jià)值[3]。特殊生境微生物的分離篩選是天然活性物質(zhì)篩選的前提。

特殊生境微生物的分離要充分考慮自然環(huán)境中的各種影響因素，如溫度、pH、群落關(guān)系等，培養(yǎng)方法和技術(shù)的研發(fā)至關(guān)重要。本文中從培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、新培養(yǎng)技術(shù)等方面綜述目前特殊生境微生物分離培養(yǎng)技術(shù)的研究進(jìn)展。

1 制約特殊生境微生物培養(yǎng)的因素

微生物在實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)時(shí)，因環(huán)境的改變，無法立即適應(yīng)而進(jìn)入一種只維持代謝活動、不生長繁殖的休眠狀態(tài)，稱為“活的非可培養(yǎng)狀態(tài)”[4]。影響微生物培養(yǎng)的原因復(fù)雜多樣，非生物因素、生物因素及兩者之間的互相作用等均會影響微生物在人工環(huán)境中的生長。生長時(shí)間、溫度、pH、氧濃度、壓力、氧化還原電位和鹽濃度等是直接影響微生物生長和新陳代謝的重要理化因素，這些條件能決定每個(gè)物種的特征和生長速度。在某些情況下，環(huán)境的改變也會影響微生物的生長，如從深海中分離到的耐壓菌無法在常壓下存活，微好氧菌僅在低氧分壓下生長繁殖，因此，微生物分離技術(shù)應(yīng)考慮設(shè)計(jì)合適的物理、化學(xué)和生物參數(shù)[5]。群體感應(yīng)( quorum sensing，QS)也是制約特殊生境微生物難培養(yǎng)的關(guān)鍵因素。QS是細(xì)菌自發(fā)產(chǎn)生的一種群體行為，細(xì)菌釋放一些特定的信號分子，通過感知其濃度變化，調(diào)控微生物的生物行為[6]。環(huán)磷酸腺苷( cAMP)、?；呓z氨酸內(nèi)酯類( AHLs)等是目前發(fā)現(xiàn)的QS信號分子[7-8]。除了生物因素和非生物因素之外，影響特殊生境微生物生長的因素還包括特殊生境的難復(fù)原性，如海洋熱液噴口、火山噴口、極地寒冷環(huán)境等特殊生境微生物生長條件極其復(fù)雜，因此無法人工模擬。總之，微生物不可培養(yǎng)的原因主要有以下2個(gè)方面：一是某些自然環(huán)境很難模擬，因此不可能人為地完全復(fù)制其真實(shí)生長環(huán)境；二是目前研究能力有限，對微生物生長條件、規(guī)律及其生存環(huán)境的復(fù)雜性認(rèn)識還不夠充分[9]。

2 經(jīng)典培養(yǎng)方法優(yōu)化

2.1 設(shè)計(jì)合適的培養(yǎng)基

合適的培養(yǎng)基是微生物分離培養(yǎng)的先決條件，設(shè)計(jì)滿足不同生境微生物生長的培養(yǎng)基對微生物工作者來說任務(wù)非常艱巨。改變培養(yǎng)基成分是提高微生物的可培養(yǎng)性的常用策略。目前，實(shí)驗(yàn)室常用培養(yǎng)基為富營養(yǎng)培養(yǎng)基，但是特殊環(huán)境微生物大多在低營養(yǎng)環(huán)境中生存。尤其是專性寡營養(yǎng)微生物的生存環(huán)境中有機(jī)碳質(zhì)量濃度僅為mg/L水平[9]，將這類嗜寡營養(yǎng)微生物轉(zhuǎn)移到營養(yǎng)充沛的人工培養(yǎng)基時(shí)，高濃度營養(yǎng)物質(zhì)反而會抑制它們的生長[10]，因此，研究者在分離寡營養(yǎng)環(huán)境中的微生物時(shí)，大多采用稀釋傳統(tǒng)培養(yǎng)基的方法，如Janssen等[11]分離土壤樣品時(shí)采用稀釋培養(yǎng)基、延長培養(yǎng)時(shí)間、超聲波處理樣品相結(jié)合的方法，成功獲得多個(gè)門類的新微生物。低濃度營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基雖然能使微生物生長，但是營養(yǎng)成分過少無法滿足微生物的生長需求，會阻礙微生物的生長[12-13]，因此，增加營養(yǎng)成分種類能大幅提高微生物分離培養(yǎng)的出菌率。近幾年，一種被稱為土壤提取物瓊脂培養(yǎng)基的新型培養(yǎng)基用于分離培養(yǎng)土壤中的微生物，獲得了一些新的細(xì)菌和放線菌[14]。

在研究微生物的新陳代謝時(shí)，微生物學(xué)家發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中不同的電子供體、電子受體和碳源對很多微生物有影響。Santini等[15]從金礦中分離出一種未知的化能自養(yǎng)型亞砷酸鹽氧化細(xì)菌，命名為NT -26，該菌株以氧為受體，亞砷酸鹽為電子供體，其16S核糖體DNA(rDNA)基因序列比對結(jié)果顯示，NT - 26為α - 變形菌門的根瘤農(nóng)桿菌分支中的一個(gè)新種。Schink等[16]從海洋沉積物中篩選到一種新的無機(jī)化能自養(yǎng)細(xì)菌，即亞磷酸氧化產(chǎn)脫硫菌，該菌株以亞磷酸為電子供體，以硫酸鹽為電子受體。Uphoff等[17]在研究北海水樣微生物多樣性過程中發(fā)現(xiàn)，碳源質(zhì)量是微生物生長繁殖的決定因素，與僅含有一種碳源的培養(yǎng)基相比，含有多種復(fù)雜化合物碳源培養(yǎng)基能獲得多種菌株。許多自養(yǎng)微生物無法在一個(gè)固定碳源的培養(yǎng)基上生長[18]。Rettedal等[19]對人類腸道微生物種群進(jìn)行研究，采用優(yōu)化選擇培養(yǎng)條件的方法，在培養(yǎng)基中添加不同碳源、微量元素混合物、抗生素等，分離出4種典型菌株，其中2種為新菌種。Kawanishi等[20]設(shè)計(jì)開發(fā)了2個(gè)限制條件的高度選擇性培養(yǎng)基，應(yīng)用該選擇培養(yǎng)基，分離出水稻谷枯病原菌、青枯病原菌等。

瓊脂對某些微生物的生長有抑制作用，選用瓊脂替代物培養(yǎng)特殊生境微生物能提高其可培養(yǎng)性。微生物學(xué)家發(fā)現(xiàn)，吉蘭糖膠能有效分離培養(yǎng)淡水沉積物中迄今未發(fā)現(xiàn)的微生物。Tamaki等[21]的研究表明，吉蘭糖膠培養(yǎng)基上的菌落數(shù)比瓊脂培養(yǎng)基上的多10倍，約60%為新種；在相同條件下，吉蘭糖膠培養(yǎng)基上分離出的新菌種僅有約1/2能在瓊脂培養(yǎng)基上形成菌落。

2.2 摸索合適的生長條件

特殊生境微生物的生長條件極其嚴(yán)格，限制其生長的因素主要包括生長時(shí)間、接種量、溫度、pH和空氣條件。

2.2.1 生長時(shí)間

由于微生物的生長周期存在差異，因此分離生長慢的微生物時(shí)，可采用增加培養(yǎng)時(shí)間的方法。延長培養(yǎng)時(shí)間能夠增加環(huán)境中非優(yōu)勢微生物的分離成功率。倍增時(shí)間為48 h的慢增長微生物從單一細(xì)胞長成一個(gè)肉眼可見的菌落需要30 d左右[22]。Janssen等[11]采用延長培養(yǎng)時(shí)間的方法從土壤中分離得到多種酸桿菌門和疣微菌門的新種，但是，微生物培養(yǎng)周期不能無限增加，原因是延長微生物培養(yǎng)時(shí)間易導(dǎo)致污染，對培養(yǎng)環(huán)境的無菌要求會越高[23]。

2.2.2 接種量

減少接種量能促使活菌數(shù)增加，但并不影響微生物菌落的形成[24]。Davis等[24]研究發(fā)現(xiàn)，接種量每減少1/10，最終活菌計(jì)數(shù)增加2倍，活菌計(jì)數(shù)的精確度隨著每個(gè)板上菌落數(shù)的減少而降低，并且隨著接種量的減少，活菌數(shù)量會增加。

2.2.3 溫度

低溫會降低微生物的代謝率，同時(shí)生長抑制物質(zhì)的生產(chǎn)率也會下降，會誘導(dǎo)出更多菌株，如土壤細(xì)菌在20～25 ℃時(shí)的生長效果比30 ℃時(shí)的好[25]。特別是來源于寒冷地區(qū)的樣品，培養(yǎng)溫度應(yīng)與其環(huán)境條件接近。例如，在古老的多年凍土沉積物中，采用低溫恢復(fù)策略成功分離出多種微生物。延長低溫培養(yǎng)時(shí)間可使一些以前不可培養(yǎng)的菌類獲得分離，如蛋白菌、高G - C含量(鳥嘌呤和胞嘧啶在DNA的4種堿基中所占的分?jǐn)?shù))革蘭氏陽性菌和低G - C革蘭氏陽性菌[26]。

2.2.4 pH

pH是影響微生物生長的關(guān)鍵因素，可以根據(jù)實(shí)際采樣pH進(jìn)行調(diào)整[25]。最常用的營養(yǎng)培養(yǎng)基pH接近中性。泥碳中的大部分細(xì)菌在pH為3.5～5.5的酸性泥碳水培養(yǎng)基上生長，而在傳統(tǒng)培養(yǎng)基上不生長，因此一些泥碳甲烷氧化菌用溫和酸性培養(yǎng)基分離出來[27]。土樣中的酸桿菌用中等酸性條件分離出來[28]。

2.2.5 空氣條件

不同來源的微生物對空氣條件需求各異。根據(jù)微生物對氧氣的需求程度，將其分為好氧、微好氧、厭氧、兼性厭氧型等。Janssen等[29]利用稀釋培養(yǎng)技術(shù)分離水稻缺氧土樣中的糖分解菌，分離出3株疣微菌目的兼性厭氧超微細(xì)菌；模擬自然條件，通過多因素實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)甲烷菌在自然有氧條件下仍能產(chǎn)生甲烷，在有氧條件分離了2株能產(chǎn)甲烷的細(xì)菌[30]。

2.3 群體培養(yǎng)與共培養(yǎng)

Kaeberlein等[31]發(fā)現(xiàn)，環(huán)境中的大部分微生物會抵觸實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，一些分離的菌株能在模擬的自然環(huán)境中生長，在人工培養(yǎng)基上無法獨(dú)自生存，有其他微生物存在時(shí)便能形成肉眼可見的菌落，這說明微生物種間與種內(nèi)需要信號分子進(jìn)行交流。信號分子cAMP和AHLs被添加到培養(yǎng)基中來滿足微生物生長繁殖的需求。與AHLs相比，cAMP能使更多細(xì)菌得到培養(yǎng)[8]，但是僅添加某些化合物很難將有些微生物分離出來，可通過群體培養(yǎng)或共培養(yǎng)的方法進(jìn)行分離。如Plugge等[32]采用透析培養(yǎng)系統(tǒng)富集生長緩慢的中度嗜熱厭氧菌，以谷氨酸鹽為唯一碳源和能源的谷氨酸降解菌在1 a內(nèi)細(xì)胞數(shù)量增加了400倍，并且發(fā)現(xiàn)了一株能降解谷氨酸的新產(chǎn)甲烷菌Z，菌株Z的存在促進(jìn)了谷氨酸降解菌的生長。Kaeberlein等[31]發(fā)現(xiàn)，從擴(kuò)散盒中分離的很多細(xì)菌只能與同一環(huán)境中的其他細(xì)菌共存。Egan等[33]發(fā)現(xiàn)，短雙歧桿菌UCC2003僅在雙歧桿菌PRL2010存在時(shí)才能利用黏蛋白。Dubey等[34]用金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌研究細(xì)菌間通訊時(shí)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞熒光物質(zhì)能在相鄰細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移，原因是相鄰細(xì)胞間有不同大小的納米管存在。納米管是自然界中細(xì)菌間通訊的主要形式，為物種之間的分子交換提供了一個(gè)網(wǎng)絡(luò)。

2.4 高通量培養(yǎng)技術(shù)

特殊生境中的寡營養(yǎng)微生物在人工培養(yǎng)時(shí)，其中的優(yōu)勢微生物會抑制寡營養(yǎng)微生物的生長。為了解決這一問題，Button等[35]提出稀釋培養(yǎng)法，即通過極限稀釋減少優(yōu)勢微生物對寡營養(yǎng)微生物的影響，提高寡營養(yǎng)微生物的可培養(yǎng)性。Hahnke等[36]將藻華水樣稀釋后，用含有微摩爾底物養(yǎng)分的人造海水培養(yǎng)基分離出極易引起藻華的浮游細(xì)菌。Connon等[37]基于稀釋培養(yǎng)法提出高通量培養(yǎng)法，使用微量滴定板和新開發(fā)的制備細(xì)胞陣列的方法來提高高通量速率和檢測靈敏度，用該方法培養(yǎng)了海洋中數(shù)量多達(dá)14%的細(xì)菌。高通量培養(yǎng)技術(shù)分離出的菌株數(shù)量比傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)技術(shù)分離出的菌株數(shù)量增加了14～1 400倍。Colin等[38]利用高通量培養(yǎng)方法對河口底泥樣品進(jìn)行分析，從384孔微孔板中成功獲得了許多硫酸鹽還原菌的純培養(yǎng)。Rappé等[39]利用高通量培養(yǎng)法，設(shè)計(jì)難培養(yǎng)海洋細(xì)菌SAR11的同源分子探針，獲得了18種細(xì)菌的純培養(yǎng)物。高通量培養(yǎng)技術(shù)能同時(shí)操作多個(gè)單元，大幅提高了微生物的分離效率，顯著增大了分離出新菌種的可能性。

2.5 原位培養(yǎng)技術(shù)

在實(shí)驗(yàn)室中難以完全復(fù)制微生物的自然環(huán)境，使得微生物在生長過程中某些營養(yǎng)物質(zhì)匱乏和與其他生物的聯(lián)系被破壞，導(dǎo)致微生物難以在人工培養(yǎng)基上生長。Bruyn等[40]利用懸浮濾膜技術(shù)分離出中等嗜熱細(xì)菌、嗜熱嗜酸生物體氧化硫桿菌, 有效地增強(qiáng)了鐵氧化菌的可培養(yǎng)性。Kaeberlein等[31]設(shè)計(jì)了擴(kuò)散盒裝置來分離海洋微生物，成功分離出一株新菌株，圖1所示為原位培養(yǎng)擴(kuò)散生長盒，由1個(gè)環(huán)狀不銹鋼墊圈和2個(gè)孔直徑為0.03 μm的濾膜組成，濾膜允許環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)自由出入，但是細(xì)胞不能通過，比較真實(shí)地模擬了微生物所處的自然環(huán)境，有效地保證了微生物生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)及其信號分子交流。擴(kuò)散盒進(jìn)一步改進(jìn)為原位培養(yǎng)陷阱捕集器，由2個(gè)半透膜(孔徑為0.2～0.6 μm的底膜和孔直徑為0.03 μm的頂膜)組成。將捕集器粘合到具有無菌瓊脂或結(jié)冷膠的塑料洗滌器內(nèi)，底膜限制真菌的滲透，使用時(shí)直接將原位培養(yǎng)陷阱的生長盒置于自然環(huán)境中，以保證底部半透膜與土樣緊密接觸，半透膜允許環(huán)境樣品中放線菌和絲狀真菌的菌絲體進(jìn)入到生長盒中，將細(xì)菌和單細(xì)胞真菌阻擋在盒外[41]。該裝置比常規(guī)平板培養(yǎng)分離到的放線菌更豐富多樣。Ferrari等[42]基于擴(kuò)散盒的技術(shù)原理，開發(fā)了一種用于篩選土壤中難培養(yǎng)微生物的土壤基質(zhì)濾膜系統(tǒng)，該系統(tǒng)使用聚碳酸酯膜和土壤提取物的固體瓊脂作為生長底物，使用全細(xì)菌染色結(jié)合熒光原位雜交顯示不同的菌落，從土壤中分離得到難培養(yǎng)的TM7類細(xì)菌。姜明國等[43]將自制的原位培養(yǎng)裝置埋于紅樹林根際附近土壤中俘獲放線菌，共分離到113株放線菌。原位培養(yǎng)技術(shù)最大程度地還原了微生物生長的自然環(huán)境，保證了微生物間的相互作用，提高了微生物可培養(yǎng)性。

(a)由環(huán)狀不銹鋼墊圈和孔徑為0.03 μm的濾膜組成的擴(kuò)散盒表面的擴(kuò)散盒 (b)置于海洋沉積物 圖1[31] 原位培養(yǎng)擴(kuò)散生長盒

2.6 細(xì)胞微囊包埋技術(shù)

Zengler等[44]利用細(xì)胞微囊法， 在將凝膠微滴中的細(xì)胞封裝在低營養(yǎng)流量條件下進(jìn)行大規(guī)模平行培養(yǎng)， 然后利用流式細(xì)胞儀檢測含有菌落的微滴， 流程如圖2所示。 該方法廣泛應(yīng)用于分離海水、土壤等環(huán)境樣品中的微生物[45]。 Bendov等[46]研究出一種雙層包埋技術(shù)，依次用瓊脂、聚砜聚合物膜將微生物包被，置于自然環(huán)境中培養(yǎng)， 分離到多種新的微生物菌種，其16S rDNA序列分析顯示，相似性僅為

圖2[44] 細(xì)胞微囊包埋法流程圖

85% ～96%。Jiang等[47]在微囊包埋技術(shù)的基礎(chǔ)上開發(fā)了一種高通量微生物細(xì)胞分離培養(yǎng)的微流控條紋板法，用于研究北京郊區(qū)一個(gè)廢棄焦化廠土壤微生物的多樣性， 并從該多環(huán)芳烴富集的土壤中分離出4種分支桿菌和1種降解熒蒽的未知芽球菌屬。隨著信息技術(shù)的發(fā)展，由數(shù)百個(gè)微型擴(kuò)散室構(gòu)成的高通量的微生物分離芯片應(yīng)運(yùn)而生。利用該芯片分離到大量微生物,約1/2為微生物新種[48]。Jung等[49]在研究俄羅斯貝加爾湖淡水海綿微生物的多樣性時(shí)開發(fā)了I - tip技術(shù)，將微生物分離芯片與原位培養(yǎng)完美地結(jié)合，培養(yǎng)出更具多樣性的微生物。

3 分子生物學(xué)方法在發(fā)掘特殊生境微生物中的應(yīng)用

隨著環(huán)境微生物基因組提取方法的不斷改良， 分子生物學(xué)飛速發(fā)展， 并廣泛應(yīng)用于特殊生境微生物研究。 例如， 基于微生物基因組中特定基因、 序列引導(dǎo)分離技術(shù)通過設(shè)計(jì)引物或雜交探針， 以培養(yǎng)物中靶向序列的變化為標(biāo)準(zhǔn)， 優(yōu)化微生物培養(yǎng)條件， 培養(yǎng)出新的微生物。 Liebner等[50]通過熒光原位雜交發(fā)現(xiàn)永久凍土中的優(yōu)勢菌群為擬桿菌和放線菌。 近幾年發(fā)展起來的宏基因組學(xué)直接從自然環(huán)境中的樣品提取全部微生物的基因組， 進(jìn)而分析微生物的多樣性、 進(jìn)化關(guān)系等。 Albertsen等[51]利用宏基因組學(xué)技術(shù)， 分析活性污泥生物反應(yīng)器中的樣品， 組裝出包括稀有物種的31株細(xì)菌的基因組， 其中12株細(xì)菌已拼出全基因組， 4株屬于候選細(xì)菌門TM7， 代表迄今為止這個(gè)門最完整的基因組(相對豐度為0.06%～1.58%)。 此外， 單細(xì)胞基因組測序技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生， 該新技術(shù)在單細(xì)胞水平對全基因組進(jìn)行擴(kuò)增與測序， 在獲得特殊生境中難以培養(yǎng)微生物的遺傳信息方面發(fā)揮了巨大作用， 應(yīng)用前景廣闊[52]。

4 結(jié)論與展望

近年來，新穎的培養(yǎng)方法與技術(shù)相繼問世，廣泛應(yīng)用于微生物新菌種的發(fā)現(xiàn)。利用三維(3D)打印技術(shù)加工的微流控芯片與細(xì)胞尺寸相匹配，具有分析速度快，分離效率高，試劑樣品消耗量小，可操作性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于微生物單細(xì)胞分離分析，如用微流控芯片技術(shù)鑒定多重細(xì)菌[53]，檢測出霍亂弧菌、沙門菌、志賀氏菌等食源性致病菌[54]。微生物研究者通過不懈努力，采用多種多樣的微生物分離方法(見表1)，從特殊生境中發(fā)現(xiàn)了許多新菌種，如崔慶鋒等[55]從酸性土壤中篩選嗜酸放線菌，得到20株稀有放線菌代表菌株，其中2株屬于至今尚未命名的新科Ellin5034 group。

表1 特殊生境微生物培養(yǎng)方法

微生物分離培養(yǎng)是特殊生境微生物資源開發(fā)的前提，快速、有效分離微生物的方法體系是不可或缺的。由于理化因素直接影響微生物的生長繁殖，QS能控制微生物的群體行為，因此，特殊生境微生物的分離要充分考慮這些生物因素與非生物因素的影響，盡量模擬微生物自然生存環(huán)境，并采用多種行之有效的技術(shù)方法，與其他學(xué)科技術(shù)相結(jié)合，取長補(bǔ)短，才能從特殊生境中分離更多的微生物，為新穎結(jié)構(gòu)生物活性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)、促進(jìn)微生物生化藥學(xué)的發(fā)展奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。