黃 雯，李阿池，胡應(yīng)平，楊志堅(jiān)，明艷林，陳 輝

(1.福建省亞熱帶植物研究所/福建省亞熱帶植物生理生化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 361006；2.漳州市速生豐產(chǎn)林基地管理中心，福建 漳州 363000；3.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建 福州 350002)

枳椇Hovenia acerba，別名拐棗、雞爪梨，鼠李科Rhamnaceae枳椇屬植物，落葉大喬木，分布于我國(guó)華北南部至長(zhǎng)江以南地區(qū)，南亞國(guó)家也有分布，一般生于海拔2100 m以下山區(qū)疏林中、林緣、開(kāi)曠地，集果、藥、材、觀賞于一身，生長(zhǎng)快，適應(yīng)性強(qiáng)，極具開(kāi)發(fā)價(jià)值。枳椇在福建省內(nèi)多數(shù)地區(qū)均有分布，主要分布在閩西北山區(qū)，但近年來(lái)因森林破壞導(dǎo)致枳椇資源量銳減[1]。福建省背靠武夷山脈，受亞熱帶海洋性季風(fēng)氣候影響，四季分明，溫暖濕潤(rùn)，光照充沛，所產(chǎn)枳椇果大、汁多、味甜而無(wú)苦澀味，在品質(zhì)、產(chǎn)量等方面都優(yōu)于長(zhǎng)江以南其他省區(qū)。野生枳椇在福建境內(nèi)分布較廣，資源量大，具有規(guī)模栽培和產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)前景[2]。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)枳椇的研究多集中在果實(shí)活性成分提取、藥理與栽培等方面[3—8]，在種質(zhì)資源遺傳多樣性與DNA分子鑒別方面僅見(jiàn)RAPD分析[9—10]。ISSR標(biāo)記技術(shù)結(jié)合了SSR標(biāo)記和RAPD標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)，克服了RAPD標(biāo)記的缺點(diǎn)[11]，具有樣品用量少、操作簡(jiǎn)單、可靠性與重復(fù)性好、多態(tài)性高等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性研究[12—17]。本文建立和優(yōu)化了枳椇ISSR分子標(biāo)記體系，對(duì)福建省12個(gè)種源地35個(gè)枳椇?jiǎn)沃赀M(jìn)行遺傳多樣性分析，探討其親緣關(guān)系，旨在更好地了解福建省枳椇種質(zhì)資源情況，為枳椇良種選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

材料來(lái)源于福建省12個(gè)種源地的35株枳椇，地理位置見(jiàn)表1。植物基因組DNA提取試劑盒購(gòu)于杭州博日科技有限公司，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，ExTaqDNA聚合酶與dNTP購(gòu)于大連寶生物技術(shù)有限公司。

表1 供試枳椇種源地概況Table 1 The overview of Hovenia acerba sources

1.2 方法

1.2.1 枳椇基因組DNA制備 使用Biospin植物基因組DNA提取試劑盒提取枳椇嫩葉基因組DNA。提取的DNA經(jīng)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 枳椇ISSR反應(yīng)體系建立與優(yōu)化 參考劉興菊等[18]的鼠李科棗屬I(mǎi)SSR體系，設(shè)立ISSR-PCR基本反應(yīng)體系：總體積 25 μL，10×ExTaqBuffer(Mg2+plus) 2.5 μL，dNTP Mixture 375 μmol·L-1，引物0.2 μmol·L-1，DNA 模板 50 ng，ExTaq酶 1.5 U，ddH2O 15.95 μL。對(duì)引物(0.1、0.2、0.3、0.4 μmol·L-1)、dNTP Mixture (125、250、375、500 μmol·L-1)、模板 DNA (25、50、75、100 ng)、Taq酶(0.5、1.0、1.5、2.0 U)做優(yōu)化篩選。分別設(shè)置某一成分梯度變化，其他成分采用基本反應(yīng)體系，比較擴(kuò)增效果。

1.2.3 DNA擴(kuò)增與 PCR產(chǎn)物檢測(cè) 采用優(yōu)化的 ISSR反應(yīng)體系，在溫度梯度熱循環(huán) PCR儀(德國(guó)EPPENDORF Master-cycler05331)中擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物與1/6體積的6×Loading Buffer混勻，上樣7.5 μL于含0.5 μg·mL-1EB的1% TAE瓊脂糖凝膠上，1×TAE電泳緩沖液，電壓110 V電泳1.5 h，用標(biāo)準(zhǔn)λDNA(2000 Marker，博日科技)作對(duì)照，凝膠成像系統(tǒng)紫外光下觀察并成像。

1.2.4 引物篩選 以提取的多個(gè)DNA樣品為模板，對(duì)50條ISSR引物進(jìn)行篩選，最終篩選出10條擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定性好、多態(tài)性較高的引物(表2)。

表2 篩選出的ISSR引物序列Table 2 The sequences of ISSR primers

1.2.5 擴(kuò)增與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 利用篩選的 10條引物對(duì)35個(gè)供試材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳得到指紋圖譜。人工檢測(cè)條帶的有無(wú)，當(dāng)某一位點(diǎn)擴(kuò)增帶出現(xiàn)時(shí)，賦值為“1”，不存在時(shí)賦值為“0”，從而把圖形數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成二元數(shù)據(jù)。假定種群在這些分子標(biāo)記位點(diǎn)處于哈迪-溫伯格平衡狀態(tài)，利用POPGENE32軟件計(jì)算遺傳參數(shù)：觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon多樣性指數(shù)(I)、Nei’s遺傳距離和遺傳相似性，并根據(jù)遺傳相似性，采用NTsys 2.10e軟件進(jìn)行UPGMA聚類(lèi)分析，構(gòu)建親緣關(guān)系樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR反應(yīng)體系的優(yōu)化

2.1.1 引物濃度 引物濃度會(huì)影響特異性，濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增，太低則擴(kuò)增產(chǎn)物太少。從圖1: a可以看出，當(dāng)引物濃度為0.1 μmol·L-1時(shí)無(wú)條帶；當(dāng)引物濃度為0.2 μmol·L-1時(shí)擴(kuò)增的條帶較模糊；當(dāng)引物濃度為0.4 μmol·L-1時(shí)條帶最明亮、清晰。因此，引物最佳濃度為0.4 μmol·L-1。

2.1.2 dNTP濃度 dNTP是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的原料。在PCR反應(yīng)中，dNTP濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤摻入，過(guò)低則影響擴(kuò)增產(chǎn)量和合成效率，甚至?xí)騞NTP過(guò)早消耗而使產(chǎn)物單鏈化，影響擴(kuò)增效果。不同反應(yīng)體系，dNTP最佳濃度不盡相同。從圖1: b可以看出，dNTP濃度為125 μmol·L-1時(shí)，擴(kuò)增出的條帶十分模糊；dNTP濃度為500 μmol·L-1時(shí)完全沒(méi)有擴(kuò)增出條帶；dNTP濃度為375 μmol·L-1時(shí)，擴(kuò)增的條帶最明亮、清晰，故此濃度為最佳濃度。

2.1.3 模板DNA含量 從圖1: c可以看出，模板DNA用量為25 ng時(shí)，擴(kuò)增出的條帶十分模糊；模板用量為75 ng和100 ng時(shí)擴(kuò)增的帶條明亮、清晰。PCR擴(kuò)增時(shí)，模板DNA含量過(guò)低會(huì)導(dǎo)致無(wú)擴(kuò)增條帶；但含量過(guò)高時(shí)，由于提取的DNA純度無(wú)法達(dá)到100%，其過(guò)高含量的抑制物質(zhì)會(huì)對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)生抑制。因此，選擇75 ng為最佳模板DNA用量，即濃度為3 ng·μL-1。

圖1 引物、dNTP濃度以及DNA模板、Taq酶含量對(duì)枳椇ISSR-PCR的影響Fig.1 Effect of the content of primer, dNTP, template DNA and Taq polymerase on ISSR-PCR from Hovenia acerba

2.1.4Taq酶含量Taq酶含量的選擇與模板DNA含量、擴(kuò)增片段大小等有關(guān)，酶量過(guò)多易發(fā)生非特異性反應(yīng)，還可能增加突變的機(jī)率，尤其在進(jìn)行高保真擴(kuò)增時(shí)，應(yīng)盡量減少酶量。但酶量過(guò)少時(shí)反應(yīng)性能會(huì)下降。從圖1: d可以看出，當(dāng)Taq酶含量為0.5 U時(shí)條帶較淡；當(dāng)Taq酶含量為1 U時(shí)擴(kuò)增效果最好；當(dāng)Taq酶含量為2 U時(shí)，出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，帶型出現(xiàn)彌散現(xiàn)象。因此，選擇1 U為最優(yōu)酶含量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

優(yōu)化后的枳椇ISSR-PCR擴(kuò)增體系：反應(yīng)總體積25 μL，10×ExTaqBuffer (Mg2+plus) 2.5 μL，dNTP Mixture 375 μmol·L-1，引物 0.4 μmol·L-1，DNA 模板 75 ng，ExTaq酶 1 U，ddH2O 14.55 μL。程序：預(yù)變性 94 ℃ 5 min；變性 94 ℃ 30 s，退火 50 ℃ 1 min，延伸 72 ℃ 90 s，35 個(gè)循環(huán)；最后延伸 72 ℃ 7 min。

2.2 ISSR擴(kuò)增結(jié)果與多態(tài)性

采用優(yōu)化的ISSR反應(yīng)體系及篩選出的10條引物對(duì)35個(gè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。共擴(kuò)增出基因組DNA中175個(gè)位點(diǎn)，分子量范圍100～2000 bp。其中，多態(tài)性位點(diǎn)155個(gè)，占擴(kuò)增總位點(diǎn)數(shù)的88.57%。每條引物擴(kuò)增的位點(diǎn)數(shù) 15～23個(gè)，平均擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)17.5(表3)。擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)最多的為引物ISSR14，達(dá)23個(gè)；最少的為引物ISSR4、ISSR22、ISSR33，各有15個(gè)位點(diǎn)。多態(tài)性最好的是引物ISSR13，擴(kuò)增出20個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)性100.00%(圖2：A)。擴(kuò)增的175個(gè)位點(diǎn)中，有20個(gè)為各基因型所共有，為35個(gè)材料間的同源性提供了依據(jù)。此外，不同引物擴(kuò)增的位點(diǎn)數(shù)不同，同一引物不同基因型擴(kuò)增的位點(diǎn)數(shù)也不一樣，充分體現(xiàn)了枳椇基因組 DNA的多態(tài)性，說(shuō)明供試材料之間的遺傳差異性；10條引物在不同樣品間產(chǎn)生各自的特征帶譜，具有較好的重復(fù)性。引物 ISSR13、ISSR45對(duì)35個(gè)樣品擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2。

表3 ISSR各引物對(duì)35份枳椇材料的擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)Table 3 Locus amplified by ISSR primers from 35 Hovenia acerba germplasms

圖2 引物ISSR13 (A)和ISSR45 (B)對(duì)35份枳椇材料的ISSR擴(kuò)增圖譜Fig.2 Map of bands amplified by ISSR13 and ISSR45 from 35 Hovenia acerba germplasms

2.3 基于ISSR標(biāo)記的枳椇種質(zhì)資源遺傳關(guān)系分析

為了確定各供試材料之間的遺傳關(guān)系，通過(guò) ISSR標(biāo)記，假定處于哈迪-溫伯格平衡下，計(jì)算 35份枳椇材料的觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon多樣性指數(shù)(I)、Nei’s(1972)遺傳距離與遺傳相似性。從表4可以看出，枳椇35份材料群體的Na為1.8857，Ne為1.4300，H為0.2572，I為0.3959，說(shuō)明福建省12個(gè)種源地的枳椇種質(zhì)資源遺傳多樣性豐富，具較大開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。

根據(jù)遺傳相似性進(jìn)行UPGMA聚類(lèi)分析，構(gòu)建各材料的親緣關(guān)系樹(shù)狀圖，以遺傳相似系數(shù)0.74為閾值，35份材料被分成A、B、C、D四大組(圖3)。A組包含永定、建甌、清流、永春、連城、大田等6個(gè)地區(qū)的16份資源，其中永定、建甌、清流、永春的所有樣品聚在該組，說(shuō)明四地的枳椇親緣關(guān)系較近，而來(lái)自大田的樣品26和連城的樣品3比較特殊，并未與其相同地區(qū)的其他樣品聚在一起。B組包含地理位置相鄰的松溪和浦城的全部樣品，說(shuō)明兩地枳椇親緣關(guān)系較近。C組包含了政和、大田、沙縣、順昌、福州、連城的13份資源。D組包含連城的樣品4與政和的樣品13。連城的3份樣品分別位于 A、C、D三組，說(shuō)明連城的枳椇種質(zhì)資源遺傳多樣性最豐富。

表4 供試枳椇材料遺傳多樣性參數(shù)Table 4 Summary of genic variation statistics for all loci of Hovenia acerba germplasms

圖3 35份枳椇材料ISSR標(biāo)記聚類(lèi)分析Fig.3 Dendrogram of 35 accessions of Hovenia acerba generated by ISSR data using the UPGMA method

3 討論

3.1 ISSR體系建立的問(wèn)題

ISSR優(yōu)化體系的建立，許多物種均有研究，但是不同物種間存在一定的差異。對(duì)于未見(jiàn)ISSR研究的物種可參考其近緣種的ISSR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化。本研究參考了同為鼠李科的棗屬I(mǎi)SSR反應(yīng)體系建立枳椇ISSR反應(yīng)體系[18]，且得到較好的效果。

PCR反應(yīng)涉及諸多因子，各因子均對(duì)PCR結(jié)果的穩(wěn)定性有較大影響，確定合適的反應(yīng)參數(shù)是PCR特異擴(kuò)增的前提。影響PCR反應(yīng)的主要因子包括模板DNA濃度與純度，引物、dNTP、Taq酶以及Mg2+濃度等。模板DNA濃度對(duì)PCR反應(yīng)的影響，不同研究者得到的結(jié)果差異較大。本研究顯示，用于枳椇ISSR實(shí)驗(yàn)的模板DNA最佳濃度為3 ng·μL-1，而ISSR-PCR反應(yīng)對(duì)DNA純度要求不高。

獲得豐富的條帶是分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中DNA聚合酶多用rTaq酶。本研究發(fā)現(xiàn)，改用ExTaq酶得到的條帶數(shù)是rTaq的兩倍，這可能與ExTaq的高保真性有關(guān)，且使用ExTaq后PCR的穩(wěn)定性與可重復(fù)性也比rTaq強(qiáng)。

3.2 福建省枳椇種質(zhì)資源親緣關(guān)系分析

利用篩選出的10條引物對(duì)35份枳椇種質(zhì)資源進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出基因組DNA中175個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)有155個(gè)，占擴(kuò)增總位點(diǎn)數(shù)的88.57%，說(shuō)明35份枳椇種質(zhì)資源具有較高的遺傳多樣性。對(duì)35份枳椇種質(zhì)資源進(jìn)行聚類(lèi)分析，以遺傳相似系數(shù)0.74為閾值，可分成四大組。從聚類(lèi)結(jié)果看，來(lái)自福建省12個(gè)種源地的35份枳椇種質(zhì)資源的親緣關(guān)系既與生態(tài)環(huán)境、地理來(lái)源等地域分布有關(guān)，也與人類(lèi)活動(dòng)的干預(yù)密不可分。

首先，生態(tài)環(huán)境相同、地理來(lái)源一致的枳椇種質(zhì)資源遺傳關(guān)系較近，能聚成一組，具有明顯的地域分布規(guī)律。如閩北相鄰的松溪、浦城所有樣品聚在一起，組成了B組；各縣的大多數(shù)枳椇資源較為明顯地在較近的遺傳距離上聚在一起，如永定的樣品1和2，大田的樣品6、7、8，沙縣的樣品9、10、11，政和的樣品14、15、16、17，建甌的樣品28、29、30、31、32、33、34、35等。

其次，鳥(niǎo)類(lèi)、獸類(lèi)、人類(lèi)的活動(dòng)對(duì)福建省枳椇種質(zhì)資源的親緣關(guān)系影響較大。來(lái)自大田的樣品26與大田其他3株枳椇遺傳距離相去甚遠(yuǎn)，卻與清流、永定、建甌、永春的樣品聚在一組，其中樣品26與清流的樣品25遺傳相似系數(shù)高達(dá)0.84。據(jù)調(diào)查，大田樣品26植株胸徑十分粗壯，達(dá)88 cm，樹(shù)齡也比其他枳椇高，應(yīng)在60年以上，每年產(chǎn)生大量的種子散落地表。永春、永定、大田、清流、建甌五地分屬福建省南部、中部和北部，其枳椇種質(zhì)資源在分子水平上反映出的較近的親緣關(guān)系與它們所處的地理位置形成鮮明的反差。位于北部的建甌和位于東南部的永春、西南部的永定等地相隔三四百公里，且福建是多山地區(qū)，各地之間有許多山巒相隔，清流、永定采集的枳椇種質(zhì)資源均為野生型，可排除人為引種的可能，推測(cè)可能來(lái)源于鳥(niǎo)類(lèi)或獸類(lèi)遷徒活動(dòng)傳播的枳椇種子。而建甌枳椇種植于庭院，應(yīng)是人為引種自其他地區(qū)。福州的樣品12與沙縣3份材料聚在一起，有較為接近的親緣關(guān)系，由于沙縣的3株枳椇皆為人工種植的庭院樹(shù)種，而福州的枳椇極有可能是野生的，故沙縣3份材料有人為引種自福州的可能。來(lái)自政和的樣品13與連城的樣品4聚為一組，與其他枳椇種質(zhì)資源的親緣關(guān)系都較遠(yuǎn)。采樣時(shí)調(diào)查得知，樣品13與4皆為人工種植，可能由其他較遠(yuǎn)地區(qū)引種而來(lái)。綜上，鳥(niǎo)類(lèi)、獸類(lèi)的活動(dòng)，以及人類(lèi)的引種馴化活動(dòng)促進(jìn)了福建省枳椇種質(zhì)資源的遺傳多樣性。

3.3 福建省枳椇種質(zhì)資源遺傳多樣性及其保護(hù)

研究表明，35份福建省枳椇種質(zhì)資源的最大遺傳距離為0.6004，最大相似性為0.9486，遺傳多樣性較為豐富，這與福建省的丘陵多山地貌、背靠武夷山脈的自然地理環(huán)境以及受亞熱帶海洋性季風(fēng)氣候的影響、四季分明、陽(yáng)光充沛、溫暖濕潤(rùn)的氣候條件息息相關(guān)。人為因素對(duì)福建省枳椇種質(zhì)資源的影響較大，引種馴化豐富了福建省枳椇種質(zhì)資源的遺傳多樣性，然而近年來(lái)，因森林的破壞或人為的各種因素對(duì)枳椇進(jìn)行砍伐，造成其資源量銳減。一個(gè)物種或居群的遺傳多樣性程度越高、變異越豐富、資源蘊(yùn)藏量越大，對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力就越強(qiáng)。因此，對(duì)福建省枳椇種質(zhì)資源的保護(hù)刻不容緩。

ISSR分子標(biāo)記能較好地反映枳椇種質(zhì)資源的遺傳差異，揭示其遺傳多樣性。供試的福建省12個(gè)種源地35份枳椇材料存在著豐富的遺傳多樣性。研究結(jié)果對(duì)福建省枳椇種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)利用、良種選優(yōu)、雜交育種、資源保護(hù)等提供了分子水平的理論依據(jù)。