蔣 妮，宋利沙，陳乾平，馮世鑫，張占江，蔣水元，黃夕洋

（1.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，廣西南寧 530023；2.廣西壯族自治區(qū)中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所，廣西桂林 541006）

羅漢果（Siraitia grosvenorii）為葫蘆科多年生藤本植物，藥用干燥果實(shí)，是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，具有清熱止咳、化痰、潤(rùn)肺、生津止渴等功效，被《中國(guó)藥典》收載［1］。羅漢果還是我國(guó)特有的藥食同源植物，果實(shí)中含有高甜度且低熱量的羅漢果苷類，作為最佳的天然甜味劑得以廣泛應(yīng)用并大量出口到歐美、日本等地［2-3］。廣西是羅漢果的主產(chǎn)區(qū)及道地產(chǎn)區(qū)，全國(guó)80%以上的羅漢果產(chǎn)自廣西桂北山區(qū)［4-5］。2015年筆者首次報(bào)道在桂林等主產(chǎn)區(qū)發(fā)生一種嚴(yán)重影響羅漢果生長(zhǎng)的新病害——羅漢果斑枯病，發(fā)病率達(dá)84.0%，受害植株葉片早期出現(xiàn)凹陷狀斑點(diǎn)，后期葉片枯萎，植株枯死，嚴(yán)重影響羅漢果的生長(zhǎng)，經(jīng)鑒定病原菌為子囊菌，霉靈、戊唑醇、咪鮮胺等化學(xué)藥劑對(duì)病原菌絲的生長(zhǎng)有強(qiáng)抑制作用［6］。近3年，筆者所在課題組繼續(xù)跟進(jìn)該病害的田間流行及防治研究，目前該病已成為羅漢果栽培過(guò)程中普遍發(fā)生、危害嚴(yán)重的一種病害。據(jù)農(nóng)戶反饋，推薦使用的霉靈、戊唑醇、咪鮮胺等化學(xué)藥劑雖然在一定程度上控制了病害的發(fā)生，但須逐年不斷增加濃度及使用次數(shù)，部分嚴(yán)重發(fā)生的果園已開(kāi)始出現(xiàn)抗藥性。由于羅漢果斑枯病是一種新病害，目前國(guó)內(nèi)關(guān)于病原菌的生物學(xué)特性尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬對(duì)羅漢果斑枯病菌生物學(xué)特性進(jìn)行系統(tǒng)分析，以期為掌握病害的發(fā)生規(guī)律及有效防治提供科學(xué)依據(jù)。多年來(lái)農(nóng)藥的研究進(jìn)展表明，要克服和延緩病原菌的抗藥性，進(jìn)行藥劑的復(fù)配使用，是一項(xiàng)行之有效的措施［7-8］。目前復(fù)配混用農(nóng)藥發(fā)展很快，品種較多，表現(xiàn)出了一定的優(yōu)越性和生命力［9-10］?；谒幉?、食品的安全性及環(huán)境友好等方面的考慮，筆者選擇了目前市場(chǎng)上霉靈、戊唑醇、咪鮮胺的混配制劑以及其他廣譜性的混配藥劑進(jìn)行毒力測(cè)定及田間防治試驗(yàn)，以期為羅漢果斑枯病的有效防治提供理想的混配制劑。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 羅漢果斑枯病病原菌（Stagonosporopsis cucurbitacearum），由筆者所在實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 本試驗(yàn)選取以下8種培養(yǎng)基作為供試培養(yǎng)基，并參考方中達(dá)提供的培養(yǎng)基配方［11］進(jìn)行配制，培養(yǎng)基分別為PDA（馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基）、PSA（馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基）、OA（燕麥培養(yǎng)基）、CMM（玉米粉培養(yǎng)基）、PCA（馬鈴薯胡蘿卜培養(yǎng)基）、MA（麥芽糖瓊脂培養(yǎng)基）、CA（查氏培養(yǎng)基）、WA（水瓊脂培養(yǎng)基）。

1.1.3 供試混配制劑 13種混配殺菌劑種類及生產(chǎn)廠家見(jiàn)表1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 病原菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，用直徑為6 mm的打孔器在菌落邊緣打取菌齡一致的病原菌餅（以下接種的菌餅均為此方法），分別接種至供試的8種平板培養(yǎng)基中央，每皿放置1塊菌餅，設(shè)3次重復(fù)，置于28℃霉菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.2.2 不同碳氮源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 將不加蔗糖、硝酸鈉的察氏（Czapek）培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別稱取等質(zhì)量的蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、果糖、可溶性淀粉、乳糖作為碳源；蛋白胨、硝酸銨、氯化銨、硝酸鈉、尿素、磷酸二氫銨作為氮源，以無(wú)碳、無(wú)氮的Czapek培養(yǎng)基作對(duì)照，每處理重復(fù)3次，接入菌餅后28℃霉菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，十字交叉法測(cè)量菌落直徑［12］。

表1 供試藥劑

1.2.3 不同溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 將原菌餅接種在PDA平板中央，接種后的平板分別置于5、10、15、20、25、28、30、35℃的恒溫箱中光照培養(yǎng)，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，培養(yǎng)7 d后取出，十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.2.4 不同pH值對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 用無(wú)菌的HCl（1 mol/L）和NaOH（1mol/L）水溶液調(diào)節(jié)PDA的pH值，使其pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。將菌餅分別接種至各平板中央，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，28℃霉菌培養(yǎng)箱光照培養(yǎng)5 d，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.2.5 不同光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 設(shè)置3個(gè)光照環(huán)境條件：全光照、12 h光照—12 h黑暗交替、全黑暗，將原菌餅分別接入PDA培養(yǎng)基中央，分別移入以上3個(gè)光照環(huán)境，28℃培養(yǎng)7 d，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.6 室內(nèi)毒力測(cè)定 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，將各供試殺菌劑按照有效成分含量用無(wú)菌水稀釋成不同濃度梯度的母液，再向PDA培養(yǎng)基中加入已配制好的殺菌劑母液，制成不同濃度梯度的含藥平板，以加入等量的無(wú)菌水于PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照（CK）。將菌餅分別接種至各不同濃度的帶毒平板中央，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，28℃霉菌培養(yǎng)箱光照培養(yǎng)7 d，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算各藥劑的相對(duì)生長(zhǎng)抑菌率［13］。

1.2.7 田間防治試驗(yàn) 試驗(yàn)地選擇在桂林市永福縣羅漢果種植基地，種植的羅漢果品種為永?？h當(dāng)?shù)仄贩N富農(nóng)一號(hào)，正常水肥管理。根據(jù)室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果，選取對(duì)羅漢果斑枯病菌毒力較強(qiáng)的殺菌劑進(jìn)行田間防治試驗(yàn)，藥劑的使用量以商品使用說(shuō)明為參考。施藥時(shí)間為2018年6月5日第一次施用，后每隔7 d施1次，連續(xù)施用3次，以清水為對(duì)照。每處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)噴施200m2，并于最后一次施藥后10 d進(jìn)行病害調(diào)查。由于該病害為新病害，根據(jù)田間調(diào)研結(jié)果將羅漢果葉枯病分為5級(jí)：1級(jí)：葉片無(wú)病斑；2級(jí)：病斑占葉片表面積≤20%；3級(jí)：20% ＜病斑占葉片表面積≤50%；4級(jí)：50%＜病斑占葉片表面積≤70%；5級(jí)：70% ＜病斑占葉片表面積≤100%。每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取50張葉片統(tǒng)計(jì)發(fā)病級(jí)別，計(jì)算病情指數(shù)及相對(duì)防效。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 采用Excel軟件計(jì)算毒力回歸方程和半最大效應(yīng)濃度（EC50），利用SPSS軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan's新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

由表2可知，羅漢果斑枯病菌在供試的8種培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，其中OA培養(yǎng)基為最適培養(yǎng)基，培養(yǎng)7 d后平均菌落直徑為73.15 mm，顯著大于其他7種培養(yǎng)基，菌絲密集、絨狀、略帶灰綠色。PDA、PSA培養(yǎng)基適宜該菌的生長(zhǎng)，平均菌落直徑為65.42、63.66 mm，二者差異不顯著；菌絲體較密集，絨狀，白色。該菌在PCA、MA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)均較緩慢，菌絲氣生狀，較稀疏。WA培養(yǎng)基為最不宜該菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，培養(yǎng)7 d后平均菌落直徑僅為12.06 mm，菌絲最稀松，菌落幾近透明。

表2 羅漢果斑枯病菌在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況

2.2 不同碳、氮源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

羅漢果斑枯病菌在不同碳、氮源培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況見(jiàn)表3。該病原菌能利用不同的碳、氮源進(jìn)行生長(zhǎng)，但不同碳、氮源對(duì)病原菌的生長(zhǎng)有一定的影響。以葡萄糖為碳源的菌落直徑最大，菌絲密集，長(zhǎng)勢(shì)最好；其次依次為果糖、甘露醇上菌落較大且菌絲較密集，長(zhǎng)勢(shì)良；麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉上菌絲相對(duì)稀疏，菌落直徑也顯著小于上述3種碳源；而在無(wú)碳源培養(yǎng)基中菌落長(zhǎng)勢(shì)最弱，菌絲稀疏，可見(jiàn)碳源對(duì)于該菌的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。羅漢果斑枯病菌在以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基上菌落直徑最大，長(zhǎng)勢(shì)最好；在以硝酸銨、氯化銨為氮源的條件下次之；以磷酸二氫銨為氮源的菌落直徑小于供試的其他5種氮源，且菌絲生長(zhǎng)稀疏；無(wú)氮培養(yǎng)基上菌落直徑最小，菌株生長(zhǎng)最弱，菌絲稀薄，說(shuō)明氮源對(duì)于該菌的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，蛋白胨為最適宜的氮源。

表3 羅漢果斑枯病菌在不同碳、氮源培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況

2.3 不同溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

溫度對(duì)羅漢果斑枯病菌生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖1，該病原菌可在5～35℃溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng)；溫度達(dá)到40℃時(shí)，接種菌餅直徑6 mm沒(méi)有變化，說(shuō)明菌落沒(méi)有生長(zhǎng)；5、35℃條件下雖然能生長(zhǎng)但生長(zhǎng)極緩慢；25～30℃溫度范圍內(nèi)病原菌生長(zhǎng)較好，其中28℃為羅漢果斑枯病菌的最適生長(zhǎng)溫度，此時(shí)菌落直徑最大，生長(zhǎng)狀況最佳。

2.4 不同pH值對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

pH值對(duì)羅漢果斑枯病菌生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖2，在pH值為4.0～10.0的條件下，該病原菌均能生長(zhǎng)；pH值為6.0～8.0時(shí)菌落直徑較大，病菌生長(zhǎng)較好，其中最適pH值為7.0～8.0，此時(shí)，菌落直徑最大，長(zhǎng)勢(shì)最佳。

2.5 不同光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

試驗(yàn)結(jié)果（表4）表明：全光照條件下，菌落的直徑最大；12 h光照—12h黑暗交替時(shí)，菌落直徑次之；全黑暗不利于菌絲生長(zhǎng)，菌落直徑最小。說(shuō)明全光照有利于羅漢果斑枯病菌菌絲的生長(zhǎng)。

2.6 13種混配殺菌劑對(duì)羅漢果斑枯病菌的毒力測(cè)定

表4 不同光照條件對(duì)羅漢果斑枯病菌生長(zhǎng)的影響

表5結(jié)果表明，供試的13種殺菌劑對(duì)羅漢果斑枯病菌均有不同程度的抑制作用。其中45%戊唑·咪鮮胺EC50為0.25，對(duì)病原菌的毒力最強(qiáng)；30%甲霜·霉靈、10%苯醚·甲環(huán)唑、60%吡萘·嘧菌酯、40%氟嘧菌酯·丙硫菌唑、45%吡醚·甲硫靈，這4種殺菌劑的毒力較強(qiáng)，EC50值為0.72～2.56 mg/L；12%苯甲·氟酰胺、43%氟菌·肟菌酯對(duì)病原菌的毒力相對(duì)較弱，EC50值分別為85.08、112.47。根據(jù)室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果，將毒力較強(qiáng)的（EC50＜5.0 mg/L）5種殺菌劑（45%戊唑·咪鮮胺、30%甲霜·霉靈、10%苯醚·甲環(huán)唑、60%吡萘·嘧菌酯、40%氟嘧菌酯·丙硫菌唑、45%吡醚·甲硫靈）進(jìn)行大田試驗(yàn)。

2.7 田間防治試驗(yàn)

由表6可知，在田間施用供試的5種混配殺菌劑對(duì)羅漢果斑枯病均具有防治作用，其中45%戊唑·咪鮮胺、40%氟嘧菌酯·丙硫菌唑的防治效果最好，防效分別為86.20%、84.95%；其次是10%苯醚·甲環(huán)唑、60%吡萘·嘧菌酯，防效分別為80.63%、80.44%；防治相對(duì)較差的是30%甲霜·霉靈，防效為76.58%。從試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，45%戊唑·咪鮮胺、10%苯醚·甲環(huán)唑、60%吡萘·嘧菌酯的防治效果與其毒力測(cè)定的結(jié)果都基本吻合；而30%甲霜·霉靈在毒力測(cè)定中其毒力僅次于45%戊唑·咪鮮胺，但在田間的防治效果卻顯著低于其他4種殺菌劑。

表5 13種混配殺菌劑對(duì)羅漢果斑枯病菌的毒力

表6 不同混配殺菌劑防治羅漢果斑枯病田間藥效

3 結(jié)論與討論

羅漢果斑枯病是羅漢果道地產(chǎn)區(qū)發(fā)生的一種新病害，目前在病原菌生物學(xué)特性及侵染規(guī)律尚未明確的情況下，無(wú)法有效開(kāi)展防控。為此，項(xiàng)目組在前期病原菌準(zhǔn)確鑒定的基礎(chǔ)上，首先開(kāi)展了病原菌的生物學(xué)特性研究，從不同培養(yǎng)基、不同碳氮源、不同溫度、不同pH值、不同光照條件等方面開(kāi)展了羅漢果斑枯病菌的生物學(xué)特性研究。結(jié)果表明該病原菌以O(shè)A培養(yǎng)基為最適培養(yǎng)基。不同碳、氮源對(duì)病原菌的生長(zhǎng)有一定的影響，以葡萄糖、蛋白胨為最適碳、氮源。病原菌在5～35℃內(nèi)均可生長(zhǎng)，28℃為最適生長(zhǎng)溫度，氣溫超過(guò)30℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)速率下降，說(shuō)明該菌對(duì)高溫敏感，這與該病害在田間表現(xiàn)出來(lái)的6—7月份為發(fā)病高峰，8—9月份發(fā)病有所減輕，10月份后又有所加重的發(fā)病規(guī)律吻合。病原菌生長(zhǎng)最適pH值為7.0～8.0，表明該病原菌適宜在稍偏堿的環(huán)境中生長(zhǎng)。全光照有利于羅漢果斑枯病菌菌絲的生長(zhǎng)。13種殺菌劑的室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果表明，對(duì)羅漢果斑枯病菌毒力較強(qiáng)的前5種殺菌劑，按照強(qiáng)弱依次為：45%戊唑·咪鮮胺、30%甲霜·霉靈、10%苯醚·甲環(huán)唑、60%吡萘·嘧菌酯、40%氟嘧菌酯·丙硫菌唑。而田間防效高低依次為：45%戊唑·咪鮮胺、40%氟嘧菌酯·丙硫菌唑、10%苯醚·甲環(huán)唑、60%吡萘·嘧菌酯、30%甲霜·霉靈。對(duì)比可見(jiàn)田間防治試驗(yàn)的結(jié)果與毒力測(cè)定結(jié)果存在一定差異，此種差異，在其他殺菌劑防治其他植物病害上也有類似的報(bào)道［14］，分析原因可能是田間藥效受寄主、病原菌、環(huán)境條件等多種因素制約。45%戊唑· 咪鮮胺、40%氟嘧菌酯·丙硫菌唑、10%苯醚·甲環(huán)唑、60%吡萘·嘧菌酯具有較好的推廣應(yīng)用潛力，然而，為進(jìn)一步明確防治效果，仍須開(kāi)展連年多點(diǎn)田間試驗(yàn)。