陳 龍 ，高 濤 ，唐海燕 ，李彥希 △

（1.梁平區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，重慶，405200；2.重慶市中醫(yī)院皮膚科，重慶，400011）

皮膚黑素瘤是來源于神經(jīng)嵴表皮黑素細胞轉(zhuǎn)化而成的腫瘤，是目前全球死亡率最高的皮膚腫瘤，在2015年黑素瘤全球患病人數(shù)高達351 880人，為5/10萬[1]，每年發(fā)病率都在持續(xù)增長，且特別容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，高轉(zhuǎn)移性是黑素瘤最重要的特征，也是區(qū)別于其他非黑素瘤上皮來源的皮膚癌特征之一[2]。過去20年，我們對黑素瘤侵襲的一般機制和黑素瘤特異性機制的理解都有了顯著的提高，但迄今為止還沒有有效的治療策略來應對黑素瘤細胞的侵襲特性。黑素細胞來源于神經(jīng)嵴，在發(fā)育過程中多種信號因子的作用下，遷移到毛囊、皮膚、粘膜等處，遷移過程中最重要的環(huán)節(jié)就是EMT(epithelial-mesenchymal transition上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化)，EMT過程通過破壞粘附連接和緊密連接來加速上皮細胞和細胞粘附的降解,最早在1980年由Elizabeth Hay提出[3]，他在原始的雞胚中觀察到上皮細胞向間充質(zhì)細胞過度的現(xiàn)象。在此過程中，細胞的粘附、極性、遷移等屬性都會發(fā)生改變，上皮細胞會失去它們的粘附性和極性，重組他們的細胞骨架，在一些重組細胞形態(tài)和重組基因的表達的信號分子也會隨之改變。EMT過程中間質(zhì)標記如Snail1表達增加，上皮性標記如E-cadherin則下調(diào)，這一過程已被證明在正常發(fā)育過程如中胚層和神經(jīng)嵴遷移是至關重要的[4-5]。在傷口愈合、纖維化及腫瘤轉(zhuǎn)移過程中也有著上述過程[6-8]。EMT賦予腫瘤細胞的遷移、侵襲、干細胞樣的屬性，很大程度上是腫瘤免疫抑制和復發(fā)的重要原因[9-10]。因此，抑制EMT在癌癥治療的諸多方面都非常關鍵。

尼克酸（Nicotinic acid，NA）又名維生素B3，煙酸，或維生素PP，是一種水溶性維生素，維生素B家族成員之一，本研究通過體外實驗探討尼克酸對B16-F10黑色素瘤細胞遷移是否有抑制作用，以及不同濃度尼克酸對黑素瘤細胞的影響及相關分子機制。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 主要試劑與儀器 胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公 司，DMEM購自美國Hyclone公 司，尼克酸、臺盼藍購自美國Sigma-Aldrich 公司，Transwell小室購于美國Corning公 司，光學顯微鏡購自日本Olympus公司。TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRⅡ購自日本Takara公司，細胞計數(shù)儀購自Bio-Rad公司。引物由上海嘉根生物科技有限公司合成。

1.2 方 法

1.2.1 細胞培養(yǎng)B16-F10細胞以含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。傳代后置于5%二 氧化碳培養(yǎng)箱37℃正常培養(yǎng)備用。

1.2.2 Transwell體外遷移實驗 選用 8.0μm孔徑的Transwell小室進行實驗。預先將B16-F10細胞饑餓處理2h，胰酶消化，配制成無血清細胞懸液(細胞濃度為105個/mL)。取100μL細胞懸液加入Transwell上室。然后取含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基500μL加入下室。再向上室加入不同量尼克酸PBS溶液，形成1μM,5μM,10μM三個濃度梯度，對照組加入相當量PBS。5%二氧化碳培養(yǎng)箱37℃正常培養(yǎng)24h。棉簽擦去上室膜內(nèi)細胞，甲醛固定10min；0.1%結晶紫 室溫 染色3min，蒸溜水漂洗3*5min。Transwell小室置于顯微鏡下觀察膜下表面細胞，以膜下細胞的數(shù)量表示黑色素瘤細胞遷移能力，隨機選取視5個視野拍照計數(shù)，求平均值。以上實驗重復5次。

1.2.3 細胞遷移相關基因表達變化 應用RT-PCR技術，提取取對照組及10μM尼克酸干預24h組細胞總RNA，以RNA為模版，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。再以cDNA為模版進行PCR擴增，以檢測相關目的基因表達水平。每次兩個副孔取平均值，實驗重復四次。Snail1、snail2、twist、e-cardherin及β-actin基因引物序列見表一。

1.2.4 細胞活率檢測 取對照組及10μM尼克酸干預24h組細胞懸液（細胞濃度為106個/ml），與0.4%臺盼藍溶液以9:1混合混勻，在三分鐘內(nèi)，通過細胞計數(shù)儀分別計數(shù)活細胞和死細胞。細胞活率計算方法為：活細胞率（%）= 活細胞總數(shù)/（活細胞總數(shù)死細胞總數(shù)）×100%。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS17．0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。所得數(shù)據(jù)以均數(shù)SEM表示。組間均數(shù)采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 尼克酸干預對細胞遷移的影響

通過Transwell體外遷移實驗我們發(fā)現(xiàn)，尼克酸對B16-F10黑色素瘤細胞的遷移有明顯的抑制作用，且呈濃度依耐關系（圖1）。在尼克酸干預濃度為10μM時，抑制細胞遷移效果最明顯（*P＜0.05, **P＜0.01）。

圖1

2.2 尼克酸干預對細胞遷移相關基因表達影響

10μM尼克酸干預組與對照組相比，促進腫瘤細胞遷移的相關基因snail2和twist表達明顯減少(P＜0.01)，而抑制腫瘤細胞遷移相關基因E-cardherin明顯增加（P＜0.05）。

圖2

2.3 尼克酸干預對細胞活率影響

實驗發(fā)現(xiàn)，10μM尼克酸干預組與對照組相比，細胞活率統(tǒng)計無明顯差異。提示10μM尼克酸可顯著抑制B16-F10細胞遷移，但并不影響細胞的存活。

圖3

表1 相關基因引物序列表

3 討 論

黑素母細胞高度活躍，在整個胚胎中遷移，定值于表皮基底層，最終在那里分化成成熟的黑素細胞，與表皮角化細胞均保持恒定關系。這種恒定關系主要通過鈣粘蛋白（E-cardherin、N-cardherin等）、連接蛋白和其他粘附受體使黑素細胞和周圍角質(zhì)細胞緊密聯(lián)系[11]，每一個黑素細胞通過樹突與30-40個相鄰的角質(zhì)形成細胞接觸，形成粘附結構，其形態(tài)、生長、粘附和遷移都受控于鄰近的角質(zhì)形成細胞。在黑素瘤的早期，重新活化的黑素瘤細胞在表皮中開始不受控制的增殖，表現(xiàn)為皮膚原位癌[12]，但這些黑素瘤細胞很容易受到微環(huán)境和一些分子信號的影響，刺激其侵襲性和誘導血管生長，此時，周圍角質(zhì)細胞失去對黑素瘤細胞的粘附作用，不僅如此，表皮細胞還產(chǎn)生肝細胞生長因子(HGF)，下調(diào)E-cadherin，分泌基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)，加速基底膜的破壞，并激活Notch信號，通過上調(diào)miR-222/221誘導侵襲 。瘤細胞進入真皮后主要通過淋巴（16%-47%）和血管轉(zhuǎn)移（高于70%）。因此治療黑素瘤的關鍵在于抑制瘤細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。

尼克酸是輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)及其磷酸形式NADP的組成部分，能調(diào)控細胞的能量代謝，影響氧化應激，調(diào)節(jié)細胞存活和死亡的多種途徑[12]。NA參與細胞粘附、極性、遷移、增殖和分化的調(diào)控等多種活動，最重要的是對分化細胞具有去分化功能。在煙酸缺乏癥的患者中非常重要的特征是對紫外線敏感，這是因為缺乏煙酸導致的對紫外線的損傷修復不足造成的，體內(nèi)研究表明口服煙酸可降低紫外線誘導的免疫抑制，加速紫外線照射的人HaCaT角質(zhì)形成細胞和體外皮膚的DNA修復，降低皮膚癌的發(fā)病率。雙盲隨機對照試驗證實煙酸能明顯降低日光性角化的發(fā)病率 。Ma et al.認為高濃度的NA (50mM)能調(diào)節(jié)辣椒素受體TRPV1-4的活性，超過50mM的NA 能使3T3細胞的細胞骨架分解，并能抑制爪蛙細胞內(nèi)黑素的轉(zhuǎn)運 。

本研究通過體外實驗發(fā)現(xiàn)尼克酸能明顯抑制B16-F10黑色素瘤細胞的遷移，且呈濃度依耐關系，在尼克酸干預濃度為10μM時，抑制細胞遷移效果最明顯。細胞遷移能力降低預示著轉(zhuǎn)移能力下降，因此降低了腫瘤的侵襲性，黑素瘤治療的關鍵在于抑制瘤細胞轉(zhuǎn)移，因此為NA體外治療MM提供了有力的理論依據(jù)。三期臨床實驗中每日給予1g煙酰胺的口服劑量，對386個KC患者觀察發(fā)現(xiàn)煙酰胺對KC有化學防護作用 ，但在體外黑素瘤患者需要口服的煙酸劑量目前還無文獻報道，需進一步深入研究。

鋅指蛋白家族中的Twist、Snail是調(diào)節(jié)EMT重要的轉(zhuǎn)錄因子。在黑素瘤的發(fā)病的分子機制中，snail介導的E-cadherin的下調(diào)，E-cadherin的下調(diào)被認為是癌癥進展的一個關鍵特征，與皮膚惡性黑色素瘤預后不良正相關，使得與角質(zhì)細胞的粘附力下降 ，此外snail還可以通過誘導免疫抑制加速黑素瘤的轉(zhuǎn)移 。在MM 過程中，干擾這些關鍵蛋白的表達或功能，使得細胞信號改變，進而誘導上皮細胞失去上皮特性。細胞連接主要為粘附連接，緊密連接和橋粒連接，細胞粘附蛋白對于維系上皮細胞特性尤為重要，細胞間粘附力下降還會引起細胞骨架的改變，這又反之加速細胞粘附力的下降。此外，本研究發(fā)現(xiàn)NA能使EMT上游轉(zhuǎn)錄因子snail泛素化和退化，進而使得下游的E-cadherin增高，增加細胞間的粘附。 E-cardherin上調(diào)，E-cardherin主要位于上皮組織，從而增大細胞間的粘附，有效阻止了黑素瘤細胞的活性，因此尼克酸干預下，B16-F10黑色素瘤細胞的遷移明顯受阻。因此，在體外煙酸還能抑制腫瘤細胞的遷移，綜上所述，NA能在體外抑制黑素瘤細胞的遷移，這為NA治療黑素瘤提供了又一理論基礎。

綜上所述，本研究從分子機制深入討論了體外尼克酸通過對上游轉(zhuǎn)錄因子的影響，使得下游粘附蛋白發(fā)生變化，進而改變細胞粘附，抑制黑素瘤細胞的遷移，為治療黑素瘤提供了新的臨床思路和理論基礎。