楊之雪，唐成林，李小宏，朱正威，黃思琴，代妮，吳夢佳，邱麗，安薈羽

1.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶市400016；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，重慶市400016

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種神經(jīng)退行性疾病，目前全球約有4680萬AD患者，預(yù)計(jì)到2050年，全球?qū)⒂谐^1.35億人患此病[1]。AD的主要臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性記憶下降和認(rèn)知障礙，給社會(huì)、家庭帶來沉重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前，臨床治療只能暫時(shí)緩解癥狀，多采用藥物如膽堿酯酶抑制劑鹽酸多奈哌齊。由于AD后血腦屏障結(jié)構(gòu)改變，對小分子藥物具有潛在影響。AD患者腦血流量減少，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)對化合物的吸收；緊密連接紊亂，血腦屏障通透性增加，基底膜增厚，以及構(gòu)成大腦微循環(huán)網(wǎng)絡(luò)的毛細(xì)血管密度整體降低和相關(guān)結(jié)構(gòu)缺失，減少重要營養(yǎng)物質(zhì)在血腦屏障的轉(zhuǎn)運(yùn)，也許是阻礙藥物進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，無法發(fā)揮最大療效的原因之一[2-4]。電針治療AD越來越廣泛，針?biāo)幗Y(jié)合治療AD可以增加藥效，延緩病情發(fā)展，取得顯著成效[5]。

本研究通過觀察快速老化癡呆模型小鼠SAMP8小鼠海馬區(qū)血腦屏障緊密連接、基底膜結(jié)構(gòu)和緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-5、Occludin mRNA相對表達(dá)量的改變，探討電針改善SAMP8小鼠血腦屏障結(jié)構(gòu)的機(jī)制，為臨床針?biāo)幗Y(jié)合治療AD提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

30周齡雄性SAMP8小鼠28只，及其同源抗快速老化SAMR1小鼠7只，體質(zhì)量28～35 g，北京中科澤晟科技有限公司培育，清潔級(jí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2014-0011。動(dòng)物飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心ⅠVC級(jí)動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SYXK(渝)2018-0003。分籠飼養(yǎng)于明暗12 h交替的恒溫恒濕環(huán)境，自由攝食和水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，SAMP8小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、電針組、藥物組和針?biāo)幗M，SAMR1小鼠為對照組，每組均為7只。

實(shí)驗(yàn)過程中，所有操作符合重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理相關(guān)使用要求。

1.2 儀器與試劑

鹽酸多奈哌齊片(安理申)：衛(wèi)材制藥有限公司。華龍無菌針灸針：直徑0.17 mm，長7 mm，北京大名科技有限公司。SDZ-Ⅱ型電子針療儀：蘇州醫(yī)療用品廠有限公司。低溫高速離心機(jī)：美國SⅠGMA公司。ER-182A型電子天平：日本A&D有限公司。Trizol總RNA提取液、RR037 A反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ，ZO-1、Claudin-5、Occludin、β-actin引物：日本TAKARA公司。AL 204型電子天平：瑞士METTLER TOLEDO公司。ThermoND 2000超微量核酸蛋白測定儀：上海GENE公司。CFX ConnectTM熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)檢測系統(tǒng)：美國BⅠO RAD公司。T 100TMPCR儀、EDTA(pH=8.0)抗原修復(fù)液、EDTA(pH=9.0)抗原修復(fù)液、檸檬酸(pH=6.0)抗原修復(fù)液、BSA、正常兔血清、乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase,AChE)一抗、二抗組化試劑盒DAB顯色劑：武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.3 方法

電針組和針?biāo)幗M小鼠固定于泡沫板上，用一次性無菌針灸針刺百會(huì)、印堂兩穴[6]，接電針儀，連續(xù)波，頻率2 Hz，電流1.0 mA，每次15 min[7]。藥物組和針?biāo)幗M予安理申，研缽研磨后混于生理鹽水，濃度0.1 g/L，4℃保存，10 ml/kg灌胃，每天1次[8]。模型組和對照組每日正常抓取1次。6 d為1個(gè)療程，療程間隔1 d，連續(xù)4個(gè)療程。

以上實(shí)驗(yàn)操作，均在固定時(shí)間由固定操作人員完成。

1.4 取材及檢測

1.4.1 取材

干預(yù)結(jié)束后，小鼠用4%水合氯醛10 ml/kg腹腔注射麻醉，打開胸腔，暴露心臟，心尖灌注0.9%氯化鈉溶液約40 ml，剪開右心耳，待小鼠肝臟完全變白且右心耳流出澄清液體后，每組取6只斷頭取腦，小鼠右半腦分離海馬和皮質(zhì)，-80℃保存；左半腦多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片。

另1只小鼠繼續(xù)灌注1%戊二醛溶液，至小鼠肢體和尾巴僵硬，斷頭取腦，修剪海馬約1×1×1 mm，2.5%戊二醛中4℃固定。以上均在冰上操作。

0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗3次，1%鋨酸固定液后固定，再漂洗3次。酒精和丙酮4℃梯度脫水，100%丙酮室溫脫水，包埋后烘箱內(nèi)固化，超薄切片機(jī)切片，厚70 nm，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛染色，Hitachi-7500透射電鏡觀察海馬血腦屏障結(jié)構(gòu)。

1.4.2 免疫組化

石蠟切片行免疫組化染色，加AChE一抗(1∶250)，4℃孵育過夜；加入生物素化二抗，DAB顯色，光學(xué)顯微鏡下觀察顏色效果，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核；脫水封片，常溫晾干，在光學(xué)顯微鏡下采圖。采用Ⅰmage-Pro Plus 6.0軟件以棕黃色作為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算積分光密度(integrated optical density,ⅠOD)。

1.4.3 qPCR

取-80℃保存的海馬組織，Trizol提取總RNA；加入異丙醇靜置10 min，12000 r/min離心15 min，75%酒精清洗2次，自然晾干；加入DEPC水，彈勻；清洗超微量核酸蛋白測定儀探頭10次，記錄總RNA純度和污染值，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RR037A操作步驟配制反應(yīng)體系，置于T100TMPCR儀中逆轉(zhuǎn)錄：37℃15 min，85℃5 s，4℃+∞。按照SYBRGreen法配制反應(yīng)體系，標(biāo)板，上機(jī)行qPCR反應(yīng)：90℃30 s，95℃5 s，60℃30 s，95℃5 s，60℃1 min，共40個(gè)循環(huán)。CFXmanager 3.1軟件讀取Ct值。以2-ΔΔCt表示每組基因相對表達(dá)量。引物序列見表1。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)(ˉ±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 電鏡

對照組緊密連接結(jié)構(gòu)正常，血管基底膜清晰完整，排列整齊有序。模型組緊密連接為開放狀態(tài)并且呈空泡狀，血管基底膜增厚，邊界不清，結(jié)構(gòu)紊亂，基底膜外出現(xiàn)大量不規(guī)則絮狀條形物，周圍組織排列稀疏。電針組緊密連接結(jié)構(gòu)較模型組排列有序，血管基底膜相對變薄。藥物組緊密連接部分開放，形成裂隙，結(jié)構(gòu)松弛，基底膜明顯增厚，結(jié)構(gòu)模糊紊亂，排列不緊密。針?biāo)幗M緊密連接結(jié)構(gòu)相對完整，排列整齊，細(xì)胞間隙光滑、連續(xù)，基底膜厚度相對正常，結(jié)構(gòu)層次清晰。見圖1。

2.2 AChE

對照組海馬細(xì)胞排列緊密有序，結(jié)構(gòu)完整。模型組海馬細(xì)胞層數(shù)和數(shù)量明顯減少，排列紊亂，間隙增大。與模型組相比，電針組海馬細(xì)胞層數(shù)增多，排列相對整齊，間隙稍減小。藥物組海馬細(xì)胞排列較紊亂，細(xì)胞間隙增大。與藥物組相比，針?biāo)幗M海馬細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)較完整，細(xì)胞層數(shù)和數(shù)量顯著增加。見圖2。

圖1 SAMP8小鼠海馬區(qū)緊密連接結(jié)構(gòu)(電鏡,×30,000)

圖2 各組海馬區(qū)AChE水平(免疫組化染色,×400)

與對照組相比，模型組海馬區(qū)AChE顯著增多(P＜0.001)；與模型組相比，電針組、藥物組和針?biāo)幗MAChE均顯著降低(P＜0.001)，其中針?biāo)幗M最低，藥物組次之，電針組最高(P＜0.05)。見表2。

表2 各組海馬AChE水平比較(ⅠOD)

2.3 緊密連接蛋白mRNA表達(dá)

與對照組相比，模型組和藥物組ZO-1、Claudin-5和Occludin mRNA表達(dá)明顯降低(P＜0.01)；與模型組和藥物組比較，電針組和針?biāo)幗MZO-1、Claudin-5和Occludin mRNA相對表達(dá)量均明顯上調(diào)(P＜0.01)，與對照組無顯著性差異(P＞0.05)。見表3。

表3 各組ZO-1、Claudin-5和Occludin mRNA表達(dá)(2-△△Ct)

3 討論

AD是一種與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，特征是認(rèn)知和學(xué)習(xí)能力隱匿性惡化[9]。雖然目前沒有治愈AD的方法，但可以通過一些治療手段延緩AD的發(fā)展。臨床上多用膽堿酯酶抑制劑鹽酸多奈哌齊等。由于藥物療效不顯著，AD的治療面臨巨大挑戰(zhàn)[10]。

藥物要達(dá)到腦內(nèi)治療部位，需要通過血腦屏障。生理狀態(tài)下，血腦屏障能夠調(diào)節(jié)血液和大腦間溶質(zhì)的交換，保護(hù)大腦免受外界干擾，維持神經(jīng)環(huán)境穩(wěn)定[11]。隨著年齡增加，血腦屏障受損程度隨之增加[12]。同時(shí)緊密連接中斷，腦血管基底膜增厚，腦血流量減少。這些都會(huì)影響藥物的吸收，最終影響臨床治療效果[4,13]。血腦屏障結(jié)構(gòu)功能紊亂，不僅導(dǎo)致多種神經(jīng)毒性分子滲漏，引發(fā)并加重AD，而且異常的血管分支和增厚的基底膜也降低了腦血流，限制分子進(jìn)入腦內(nèi)[14]。一些研究表明[3,11]，大部分藥物在AD患者腦中顯著減少，可能是由于藥物劑量不足，影響了臨床治療效果。根據(jù)Fickian擴(kuò)散定律[2,11]，AD小鼠對中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物吸收量減少可能是由于腦血管基底膜增厚和路徑長度增加，血腦屏障滲透性的改變對小分子藥物的吸收也有重要影響。由于緊密連接的破壞，改變了大腦血液及小分子的運(yùn)輸途徑，異常的血管生成、血流量改變、腦灌注量不足和炎癥反應(yīng)不僅影響藥物吸收，還會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致突觸和神經(jīng)功能損害，加重AD[15]。

SAMP8小鼠是公認(rèn)的模擬AD病理的模型小鼠，特征是認(rèn)知障礙與學(xué)習(xí)、記憶能力下降。病理表現(xiàn)有血腦屏障結(jié)構(gòu)紊亂，腦血管缺損，緊密連接受損，基底膜增厚，膽堿能系統(tǒng)改變[12,16-17]。電針作為傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的有機(jī)結(jié)合，在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面取得顯著療效。AD屬中醫(yī)學(xué)“癡呆”病的范疇，病位在腦，與腎臟密切相關(guān)，并涉及心、肝、脾諸臟。督脈是精微物質(zhì)上輸于腦的重要通路，與五臟六腑均有密切聯(lián)系，具有振奮陽氣，調(diào)節(jié)臟腑機(jī)能，改善機(jī)體精神意識(shí)和思維活動(dòng)的作用[18]。一些實(shí)驗(yàn)研究針刺百會(huì)、印堂治療AD，均有不錯(cuò)的效果[19]。

緊密連接是血腦屏障保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的基礎(chǔ)，對血腦屏障具有調(diào)節(jié)作用。ZO-1是緊密連接中最主要的胞質(zhì)蛋白，在許多神經(jīng)功能障礙疾病中，ZO-1缺乏不僅會(huì)干擾緊密連接，其水平降低也與屏障破壞相關(guān)。Claudin-5是血腦屏障主要的跨膜蛋白，也是調(diào)節(jié)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的關(guān)鍵靶點(diǎn)，能影響血腦屏障的開放程度，提高藥物在腦內(nèi)的生物利用度。Occludin是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的緊密連接蛋白，直接參與緊密連接形成。ZO-1、Claudin-5和Occludin相互作用，將跨膜蛋白和細(xì)胞骨架連接，不僅可以識(shí)別緊密連接位置，還能傳遞各類信號(hào)，是研究緊密連接的標(biāo)志蛋白[20-22]，其表達(dá)水平下降是血腦屏障損傷程度的重要標(biāo)志。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)[23-24]，ZO-1、Claudin-5、Occludin mRNA和蛋白水平的表達(dá)均有所減少。盡管AD病理?xiàng)l件下血腦屏障滲透性增加，但小分子藥物在腦內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)率卻有所下降[25]，這可能是由于分子復(fù)合物在受損的血腦屏障中產(chǎn)生滲漏[26]。調(diào)控緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-5和Occludin，有可能調(diào)節(jié)受損屏障結(jié)構(gòu)，增加大腦對藥物的吸收。

導(dǎo)致AD患者學(xué)習(xí)記憶障礙公認(rèn)的原因之一為膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)缺乏。鹽酸多奈哌齊是中樞AChE抑制劑，通過抑制對乙酰膽堿(acetylcholine,ACh)的水解，增加ACh濃度[18]。由于Ach在體內(nèi)不穩(wěn)定，故本研究檢測AChE的含量，間接反映ACh水平。

本研究顯示，電針干預(yù)后，SAMP8小鼠緊密連接結(jié)構(gòu)較為正常，排列較有序，血管基底膜變薄，結(jié)構(gòu)層次清晰；電針組和針?biāo)幗M海馬區(qū)緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-5和Occludin mRNA表達(dá)都有所增加，從而恢復(fù)血腦屏障結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；與藥物組相比，針?biāo)幗M海馬區(qū)AChE含量明顯降低，提示電針對SAMP8小鼠血腦屏障的調(diào)控，能夠增強(qiáng)藥物入腦。

目前很少關(guān)于電針對AD模型鼠血腦屏障的研究。Jung等[27]用電針對缺血性腦卒中模型小鼠進(jìn)行預(yù)處理，可顯著減輕血腦屏障破壞，增加緊密連接蛋白ZO-1和Claudin-5的表達(dá)?？缀｝埖萚28]采用針?biāo)幝?lián)用的方法，發(fā)現(xiàn)針?biāo)幗MAChE的含量明顯降低。我們推測，電針可以改善模型鼠血腦屏障紊亂的結(jié)構(gòu)，同時(shí)加強(qiáng)藥物在腦中含量。其具體機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究。