， ， ， ，元素

(1.貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴陽 550001； 2.貴州省草原監(jiān)理站，貴陽 550001)

重金屬是危害較大且來源廣泛的土壤污染物[1]，主要指生物毒性顯著的汞(Hg)、鎘(Cd)、鉛(Pb)、鉻(Cr) 以及類金屬砷 (As)，還包括具有毒性的重金屬鋅 (Zn)、銅 (Cu)、鈷 (Co)、鎳 (Ni)、錫 (Sn)。隨著經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展，重金屬污染已成為危害生態(tài)最重要的環(huán)境問題之一。工業(yè)污水的排放量和農(nóng)業(yè)化肥使用量逐年增多，重金屬離子嚴(yán)重污染水體，并在土壤中大量累積，破壞土壤生態(tài)系統(tǒng)[2]。同時，在植物中累積，降低種子的發(fā)芽率和脂肪含量，降低植物體內(nèi)一些酶的活性和葉綠素含量，抑制植物光合作用和生長發(fā)育等，嚴(yán)重影響植物發(fā)育，進(jìn)而影響動物和人類的健康[3]。

草坪草能夠吸收污染物[4-5]，對重金屬污染的土壤也有很好的修復(fù)效果[6]。白三葉(Trifoliumrepens)屬豆科(Leguminosae)，三葉草屬多年生草本植物，又名白車軸草和白花苜蓿等，多被應(yīng)用于草坪植物綠化。已有文獻(xiàn)報道白三葉對重金屬Cd脅迫有良好的耐受性[7]，同時對重金屬Zn有一定的耐受性和適應(yīng)性，在重金屬Zn污染土壤的植物修復(fù)中有著一定的潛在應(yīng)用前景[8]。此外，韋新東等研究表明，白三葉可以在低濃度的Cd和Pb污染的環(huán)境下萌發(fā)，生長[9]。在白三葉重金屬脅迫方面的研究相對較多，但不夠完善和集中。

為研究重金屬離子對白三葉的毒害情況，本實(shí)驗(yàn)?zāi)M4種不同濃度重金屬離子(Zn2+、Pb2+、Cu2+、Cd2+)對白三葉種子進(jìn)行脅迫處理，測定種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和相對胚根(芽)長等相關(guān)指標(biāo)。探討不同重金屬離子脅迫對白三葉種子萌發(fā)的影響，了解白三葉種子對四種重金屬離子的耐受性關(guān)系，為白三葉作為不同重金屬環(huán)境下的綠化植被提供理論依據(jù)，發(fā)掘白三葉在重金屬污染修復(fù)潛力。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

試驗(yàn)材料：白三葉(海發(fā)，購自于貴陽種子公司)；

供試試劑：Pb(NO3)2、CdCl2、CuSO4·5 H2O、KMnO4、ZnSO4·7 H2O、Hoagland營養(yǎng)液。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2017年6月在貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。重金屬Zn2+、Pb2+、Cu2+和Cd2+分別以溶液的形式加入培養(yǎng)皿中，根據(jù)中華人民共和國國家土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB 15618-1995)3級土壤環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)量進(jìn)行重金屬離子濃度梯度的配制，濃度梯度分別為Zn2+200，500，800，1 100，1 400 mg/L；Pb2+500，1 000，1 500，2 000，2 500 mg/L；Cu2+100，200，300，400，500 mg/L；Cd2+1，50，100，150，200 mg/L[10]，同時設(shè)置對照組。

將用于實(shí)驗(yàn)的種子進(jìn)行篩選，棄去干癟和殘缺不全的種子，用濃度為0.1%的高錳酸鉀溶液浸泡待試種子15 min，然后用蒸餾水沖洗直至紅色完全消失，用濾紙將種子表面的水分吸干。實(shí)驗(yàn)采用鋪有2層濾紙的直徑為90 mm的潔凈培養(yǎng)皿為發(fā)芽床，每個培養(yǎng)皿均勻放入50粒種子，并加入10 mL用Hoagland營養(yǎng)液配制好的重金屬溶液，空白對照組則直接加入等體積的Hoagland營養(yǎng)液。每處理重復(fù)3次。蓋上皿蓋并置于陰涼通風(fēng)處，利用自然光源對其進(jìn)行光照處理，逐日觀察并記錄發(fā)芽的種子數(shù)(以胚芽長度達(dá)到種子一半為判斷種子發(fā)芽的標(biāo)準(zhǔn)[11])。記錄10 d內(nèi)白三葉種子的發(fā)芽數(shù)，并在培養(yǎng)結(jié)束后每皿隨機(jī)挑選5顆幼苗，用鑷子將萌發(fā)的幼苗取出，濾紙吸干表面水分后分別測量其胚根長和胚芽長并記錄。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素LSD法對不同處理?xiàng)l件下的白三葉的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、胚根長和胚芽長等各項(xiàng)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用Excel 2010軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并制圖。

1.4 相關(guān)數(shù)據(jù)計(jì)算公式

發(fā)芽率(%)=(發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

發(fā)芽勢(%)=[發(fā)芽初期(前3 d)正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù)]×100%；

發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑(Gt/Dt)，Gt為處理t日的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)；

相對胚根(芽)長=[處理草種胚根(芽)長/對照胚根(芽)長]×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 重金屬Zn對白三葉種子萌發(fā)的影響

從表1可看出，在不同Zn2+濃度的處理下，種子的發(fā)芽率隨著Zn2+濃度升高呈下降趨勢，加入Zn2+的種子發(fā)芽率顯著低于對照組。對照組種子的發(fā)芽率最高達(dá)到77.33%，在Zn2+濃度為500 mg/L時，種子的發(fā)芽率出現(xiàn)了小幅度的升高，當(dāng)Zn2+的濃度大于500 mg/L時，與對照組相比發(fā)芽率顯著抑制，Zn2+濃度達(dá)到1 400 mg/L時，種子的發(fā)芽率最低，為46.67%。

重金屬Zn對種子發(fā)芽勢有抑制作用，在Zn2+脅迫下，隨著濃度升高種子的發(fā)芽勢呈下降的趨勢，濃度在800～1 400 mg/L時發(fā)芽勢顯著低于0～800 mg/L時。對照組發(fā)芽勢最高,為56.67%，當(dāng)Zn2+濃度在1 100 mg/L時，種子的發(fā)芽勢達(dá)到最低值,為15.33%。

重金屬Zn對種子發(fā)芽指數(shù)同樣有抑制作用，種子的發(fā)芽指數(shù)隨著Zn2+濃度的升高呈下降趨勢，與對照組相比高濃度顯著抑制種子發(fā)芽指數(shù)，當(dāng)濃度高于800 mg/L時，抑制作用趨于平穩(wěn)。對照組種子的發(fā)芽指數(shù)達(dá)到最高，為19.11，當(dāng)濃度超過800 mg/L時，種子發(fā)芽指數(shù)變化不顯著，Zn2+濃度為1 100 mg/L時，種子的發(fā)芽指數(shù)最低，為6.11。

表1 不同濃度Zn2+處理對種子萌發(fā)的影響

注：同列不同字母間表示差異顯著(p<0.05)。下同。

2.2 重金屬Pb脅迫對白三葉種子萌發(fā)的影響

由表2可知，重金屬Pb脅迫下，白三葉種子的發(fā)芽率總體呈下降趨勢。對照組發(fā)芽率最高，為 71.33%，當(dāng)Pb2+濃度達(dá)到1 000 mg/L時發(fā)芽率有升高趨勢，Pb2+濃度超過1 000 mg/L后整體顯著下降，在Pb2+濃度為2 500 mg/L時出現(xiàn)最低值，此時發(fā)芽率為 3.33%。

表2 不同濃度Pb2+處理對種子萌發(fā)的影響

種子的發(fā)芽勢呈下降趨勢，發(fā)芽勢顯著性與發(fā)芽率基本一致。對照組發(fā)芽勢最高，為56.67%，當(dāng)濃度超過1 000 mg/L后呈現(xiàn)下降趨勢，濃度高于1 000 mg/L的發(fā)芽勢顯著低于對照組，且在Pb2+濃度為2 500 mg/L時發(fā)芽勢降至最低，為1.33%。

發(fā)芽指數(shù)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，發(fā)芽勢顯著性同發(fā)芽率顯著性一致。對照組發(fā)芽指數(shù)最大值為16.91，在Pb2+濃度為1 000 mg/L時發(fā)芽指數(shù)有所上升，超過此濃度呈現(xiàn)顯著下降趨勢，且Pb2+濃度為2 500 mg/L時發(fā)芽指數(shù)僅為0.5。

2.3 重金屬Cu脅迫對白三葉種子萌發(fā)的影響

由表3可知，重金屬Cu脅迫下，種子發(fā)芽率隨著Cu2+濃度的增加而降低，濃度低于300 mg/L時發(fā)芽率變化不顯著，濃度高于300 mg/L呈顯著下降趨勢，當(dāng)濃度升高至500 mg/L時發(fā)芽率最低，為38%。

Cu2+對白三葉發(fā)芽勢的影響表現(xiàn)為下降趨勢，濃度小于400 mg/L時種子發(fā)芽勢變化不顯著，當(dāng)濃度達(dá)到500 mg/L時與對照組相比發(fā)芽勢顯著抑制，此時的發(fā)芽勢為37.33%。

低濃度Cu2+對種子發(fā)芽指數(shù)的影響較弱，高濃度使得發(fā)芽指數(shù)降低。濃度小于200 mg/L時發(fā)指數(shù)變化不顯著，當(dāng)濃度高于300 mg/L時與對照組相比表現(xiàn)為顯著抑制，濃度達(dá)500 mg/L時發(fā)芽指數(shù)最低，為8.96。

表3 不同濃度Cu2+處理對種子萌發(fā)的影響

2.4 重金屬Cd脅迫對白三葉種子萌發(fā)的影響

表4表明，不同濃度Cd2+脅迫下，種子發(fā)芽率隨著Cd2+濃度的增加呈先上升后下降趨勢，種子在1 mg/L的低濃度處理下表現(xiàn)為促進(jìn)作用，發(fā)芽率最高，為77.33%，超過此濃度發(fā)芽率被抑制，濃度越高抑制越明顯，直到濃度為200 mg/L時發(fā)芽率達(dá)最低，為50%。

表4 不同濃度Cd2+處理對種子萌發(fā)的影響

Cd2+對種子發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)的影響表現(xiàn)為抑制，從數(shù)據(jù)來看，發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)的趨勢與發(fā)芽率相同，低濃度抑制作用較小、高濃度顯著抑制。

2.5 4種重金屬離子處理對種子相對胚根(芽)長的影響

如圖1所示，4種重金屬離子脅迫下白三葉的相對胚根長明顯低于相對胚芽長，表明重金屬離子對胚根的影響大于胚芽。低濃度的Zn2+溶液處理對胚根生長有一定的促進(jìn)作用，Zn2+濃度在200 mg/L時種子的相對胚根長顯著高于對照組，隨著重金屬溶液濃度的升高，種子的相對胚根長呈逐漸下降趨勢，表現(xiàn)為抑制作用，當(dāng)濃度超過800 mg/L時，Zn2+對胚根的影響趨于穩(wěn)定；隨著Zn2+濃度增加相對胚芽長顯著下降，200 mg/L的低濃度處理，胚芽長與對照組相比差異極小，當(dāng)濃度高于200 mg/L時下降趨勢明顯。

圖1 不同濃度4種重金屬離子處理對種子相對胚根(芽)長的影響

低濃度的Pb2+溶液處理對胚根(芽)生長均有一定的促進(jìn)作用，Pb2+濃度在500 mg/L時相對胚根(芽)長均高于對照組，隨著濃度升高相對胚根長顯著下降接近于零，濃度較高時種子將致死不生長。

Cu2+處理下，種子的相對胚根長隨濃度的升高呈下降趨勢，低濃度的Cu2+處理對種子的胚芽生長有一定促進(jìn)作用，對胚根長影響不大，濃度為100 mg/L時，相對胚芽長顯著高于對照組，相對胚芽長與對照組差異不顯著，當(dāng)濃度高于100 mg/L時，相對胚根(芽)長均顯著低于對照組。

Cd2+處理下，種子的相對胚根(芽)長均隨濃度升高而下降，高濃度顯著抑制胚根(芽)的生長，濃度在100，150，200 mg/L時的相對胚根(芽)長變化不明顯。

3 討 論

種子的萌發(fā)和生長是植物接觸外界一切反應(yīng)的開端，也是其對外界刺激最為敏感的階段[12]。種子萌發(fā)時期的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)是判斷種子發(fā)芽能力的重要指標(biāo)，能夠直觀地反映種子的發(fā)芽速率和生長的趨勢，而它的生長狀況(如幼苗的相對胚根胚芽長)則直接與幼苗的生長及生物量相聯(lián)系[13]。通過觀察重金屬溶液處理后的種子萌發(fā)情況及胚根與胚芽的發(fā)育情況，是深入研究重金屬污染對植物影響的前提。

重金屬處理對白三葉種子的萌發(fā)具有抑制作用，4種重金屬低濃度處理，種子萌發(fā)情況與對照組相比變化較小，說明白三葉具有一定的抗低濃度重金屬能力，且低濃度的Cd2+可以加速種子萌發(fā)，已有學(xué)者證明白三葉具有較強(qiáng)的抗重金屬Cd的能力，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致[14]。濃度越高對種子萌發(fā)的抑制效應(yīng)越強(qiáng)，但超出一定濃度(如Zn2+：800 mg/L ，Cd2+：50 mg/L)之后，對發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)的抑制效應(yīng)有所消除，導(dǎo)致發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)出現(xiàn)一個小幅度的上升期或平穩(wěn)期[15]。高濃度重金屬Pb2+和Cu2+對種子萌發(fā)影響較大，由于植物活性氧代謝系統(tǒng)平衡受到影響，細(xì)胞膜遭到損傷，物質(zhì)交換不能正常進(jìn)行，導(dǎo)致植物的萌發(fā)和生長受到抑制，種子的萌發(fā)能力被打破[16]。

在不同濃度重金屬離子處理下種子相對胚根長小于相對胚芽長，表明重金屬脅迫首先影響白三葉根部的生長發(fā)育，從而抑制白三葉的生長。在種子的萌發(fā)時期，重金屬對白三葉生長發(fā)育的影響都主要體現(xiàn)在抑制白三葉的根生長，也符合已有的研究結(jié)果[17]。隨著濃度的升高胚根(芽)生長整體呈現(xiàn)顯著下降趨勢，與趙玉紅等的結(jié)果一致[18]。低濃度重金屬Zn2+和 Pb2+處理對種子的胚根(芽)生長有顯著的促進(jìn)作用，Cu2+和Cd2+處理下種子的胚根(芽)生長變化不大，低濃度重金屬溶液處理對種子胚根(芽)生長影響較小。高濃度重金屬離子脅迫對種子萌發(fā)的影響其實(shí)是不可修復(fù)的，表明大部分的種子在該環(huán)境下已經(jīng)不能正常生長或種子的某些生理結(jié)構(gòu)已經(jīng)被破壞。有研究表明，植物吸收過量的Zn2+會對植物的根系造成損害，阻礙根的生長，從而影響植物的生長發(fā)育[19]。

研究白三葉種子萌發(fā)對重金屬的響應(yīng)，應(yīng)從種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)以及相對胚根(芽)長的等多方面入手。參照國家三級土壤標(biāo)準(zhǔn)重金屬濃度范圍，分析可知白三葉對Cd2+的耐受能力最強(qiáng)，Zn2+和Cu2+次之，對Pb2+的耐受能力最弱。在Cd2+不同濃度條件下種子的發(fā)芽率均大于50%，相對胚根(芽)長大于30%，且Cd2+濃度為1 mg/L時可促進(jìn)種子的萌發(fā)。而Pb2+達(dá)到一定濃度(1 500 mg/L)后發(fā)芽率小于25%，濃度在2 500 mg/L時發(fā)芽率僅為3.33%，相對胚根(芽)小于10%。此結(jié)果與已報道的研究結(jié)論吻合，即白三葉較耐鎘，對鉛、銅、鋅耐性較差[20]。但與宋鳳鳴等試驗(yàn)結(jié)果有一定差異，可能與品種以及重金屬用量不同有關(guān)[21]。有盆栽試驗(yàn)研究認(rèn)為，白三葉能同時富集中低度銅、鎘、鉛，對復(fù)合污染的土壤具有較好的修復(fù)作用[22]。雖然白三葉能夠富集重金屬的范圍有限，但是不應(yīng)該只看重單一植物的修復(fù)效果，白三葉的高生物量和強(qiáng)大的適應(yīng)性會成為它的優(yōu)勢，從而得到更多更有效的應(yīng)用，而這需要進(jìn)行更深一步的研究。

4 結(jié) 論

綜上所述，4種不同濃度重金屬處理下，隨著濃度的升高，種子的萌發(fā)整體表現(xiàn)為抑制作用，白三葉對Cd2+的耐受能力最強(qiáng)，Zn2+和Cu2+次之，對Pb2+的耐受能力最弱；高濃度的重金屬濃度培養(yǎng)條件對白三葉種子萌發(fā)及生長發(fā)育會產(chǎn)生嚴(yán)重的阻礙作用，當(dāng)Pb2+濃度在2 500 mg/L時發(fā)芽率僅為3.33%；低濃度重金屬Zn2+、Cu2+、Pb2+環(huán)境對胚生長具有一定促進(jìn)作用；重金屬脅迫首先影響的是種子根部的生長發(fā)育，從而抑制白三葉的生長。對比4種重金屬污染條件，白三葉對鎘的耐受能力最強(qiáng)，在5種不同濃度的Cd2+條件下種子的發(fā)芽率均高于50%，且Cd2+濃度為1 mg/L時可促進(jìn)種子的萌發(fā)，因此其作為Cd污染的土壤的修復(fù)植物有一定的前景。