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(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，四川 成都 610041；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)系，四川 成都 610066)

燕麥?zhǔn)呛瘫究蒲帑湆?AvenaL.)的草本植物，是優(yōu)良的一年生糧飼兼用作物。燕麥廣泛分布于全世界五大洲76個國家，主要種植于亞洲、歐洲、北美洲北緯40°以北地區(qū)[1]。目前在生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用的燕麥包括普通栽培燕麥(皮燕麥)(A.sativa)和大粒裸燕麥(A.nuda)[2]，其中皮燕麥的種植面積最大，主要為飼用。我國主要種植裸燕麥，主要食用，少數(shù)飼用。燕麥的飼用價值較高，其籽實、稃殼、莖葉等均是各種家畜的優(yōu)良飼料。燕麥喜冷涼，耐貧瘠，可在高海拔和高緯度地區(qū)種植，已經(jīng)成為我國青藏高原高寒牧區(qū)高產(chǎn)人工草地建設(shè)的當(dāng)家草種，對緩解高寒地區(qū)家畜冬季缺草的問題具有重要的作用[3]。

圖1 供試燕麥品種醇溶蛋白電泳圖譜

目前在青藏高原地區(qū)主要種植的燕麥品種包括青引1號、青引2號等國產(chǎn)燕麥品種及部分國外進口燕麥品種，而目前對這些燕麥品種間的遺傳變異等方面的研究還較少，有必要對不同燕麥品種間的遺傳差異及親緣關(guān)系進行分析，這對燕麥品種的鑒定及雜交種質(zhì)的創(chuàng)制等方面具有重要的意義[3]。此外，在高寒地區(qū)牧草種子生產(chǎn)及推廣應(yīng)用過程中，種子的混雜情況較為嚴(yán)重，所以對不同的牧草品種建立相關(guān)的純度及真實性的鑒定技術(shù)，對于牧草品種的推廣應(yīng)用具有重要的作用。目前在牧草中包括多花黑麥草、鴨茅等都建立有相關(guān)品種的分子標(biāo)記指紋圖譜[4-5]，常用的方法技術(shù)包括醇溶蛋白電泳、SSR、SNP等DNA分子標(biāo)記電泳等[4-7]。種子醇溶蛋白電泳、SSR、AFLP等分子標(biāo)記均在燕麥種質(zhì)評價、遺傳多樣性研究等方面成功運用[8-10]。本研究采用種子醇溶蛋白電泳對目前高寒地區(qū)常用的燕麥品種開展其遺傳變異及親緣關(guān)系的分析，為燕麥品種的鑒定以及資源的保護、利用等提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

表1 供試材料

供試材料為15個飼用燕麥品種，其中青引3號、青莜3號為裸燕麥(A.nuda)，砂燕麥(A.strigosa)為二倍體栽培燕麥，其余12個燕麥品種均為普通栽培燕麥(A.sativa)，大多數(shù)品種為目前青藏高原高寒地區(qū)主要種植的品種(詳見表1)，以小麥品種中國春作為醇溶蛋白圖譜的對照。

1.2 醇溶蛋白電泳分析

1.2.1 樣品提取

每個燕麥品種隨機選取5粒種子，設(shè)置2個重復(fù)。將皮燕麥種子去皮研磨成粉末并稱重，將其轉(zhuǎn)入1.5 mL 離心管，按照1 mg加5μL 的比例加入醇溶蛋白提取液(2-氯乙醇25%+甲基綠0.05%)，室溫浸提過夜，使用前10 000 r/min離心15 min。為了鑒定品種的真實性，選擇青燕1號為檢測對象，隨機選取50粒種子，醇溶蛋白提取步驟同上。

1.2.2 A-PAGE分析

采用國際種子檢驗協(xié)會ISTA(1986)頒布的酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳(A-PAGE，pH 3.2)標(biāo)準(zhǔn)程序[11]。采用DYCZ-24 F型電泳槽(北京六一儀器廠)進行電泳，恒壓500 V，恒溫10～15 ℃，電泳1.5 h。電泳結(jié)束后用10%的三氯乙酸固定30 min，后加入1%的考馬斯亮藍R-250染液進行染色過夜，7%的醋酸溶液褪色，數(shù)碼相機采集照片保存。

1.3 數(shù)據(jù)分析

對獲得的電泳條帶按有帶記為1，無帶記為0統(tǒng)計，將醇溶蛋白條帶轉(zhuǎn)換成0，1矩陣。利用軟件NTSYS-pc 2.10計算Dice遺傳相似系數(shù)(GS)，并基于該遺傳相似系數(shù)進行非加權(quán)成對算術(shù)平均法(UPGMA)聚類分析和主成分分析(PCA)[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 醇溶蛋白多態(tài)性

15份材料共擴增出18條醇溶蛋白條帶，均為多態(tài)性條帶，醇溶蛋白位點多態(tài)率為100%(如圖1)。每個品種擴增的醇溶蛋白條帶數(shù)為4～10條，燕麥的醇溶蛋白條帶主要以遷移率較大的為主，分子量較小的位點，主要分布于α和β區(qū)域。每份品種隨機挑選5粒種子，并設(shè)置2個重復(fù)，2個重復(fù)的電泳條帶均保持一致，這也表明醇溶蛋白電泳在燕麥中具有較好的重復(fù)性(如圖1)。本研究中醇溶蛋白電泳能夠?qū)⒐┰嚨?3個品種分開，僅有青海444和青燕1號2個品種的帶型完全一致，說明醇溶蛋白對于燕麥品種具有較好的鑒別能力。此外，為了鑒定燕麥種子的真實性，隨機選擇青燕1號燕麥的50粒種子進行電泳，從電泳圖譜來看完全一致，表明該品種具有較高的純度(如圖2)，同時說明醇溶蛋白電泳是燕麥種子真實性鑒定的一種有效方法。

圖2 青燕1號燕麥品種種子純度檢測電泳圖譜

2.2 遺傳相似系數(shù)

基于醇溶蛋白數(shù)據(jù)，計算供試15個品種間的DICE遺傳相似系數(shù)，其變異范圍為0.143～1.000，平均值為0.527，說明供試品種間遺傳變異較大。其中青莜3號與青海甜燕麥的遺傳關(guān)系最遠，相似系數(shù)最低,為0.143；青海444和青燕1號的醇溶蛋白圖譜完全一致，遺傳相似系數(shù)為1.000，親緣關(guān)系最近。

2.3 聚類和主成分分析

基于醇溶蛋白的聚類分析結(jié)果(圖3)表明，供試的15個燕麥品種被分成6類。砂燕麥與其他燕麥品種的遺傳距離最遠，單獨聚為一類(Ⅰ)。第Ⅱ、Ⅵ類均只包含一份材料，分別為阿壩燕麥和青引1號，其表現(xiàn)出了與其他品種的特異性。第Ⅲ類包括了青海444、青燕1號和青海甜燕麥，其中青海444與青燕1號的親緣關(guān)系非常近。第Ⅳ類包括了青引2號、莫妮卡和駿馬3個品種。第Ⅴ類包括剩下的6個品種，其中林納、青莜3號又聚為一個亞類，青引3號與加燕2號聚為一個亞類，大漢與白燕7號聚為一個亞類。主成分分析結(jié)果與聚類分析結(jié)果基本一致，其中前3個主成分分別可以解釋總遺傳變異的56.74%、14.39%、7.35%(圖4)。

圖3 聚類分析圖

圖4 主成分分析

3 討 論

麥類作物及其近緣物種種子中的醇溶蛋白帶譜嚴(yán)格受遺傳基因控制，不受環(huán)境等外界環(huán)境因素的影響，且不同材料或者品種間差異顯著，變異類型也較豐富，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于小麥、燕麥等麥類作物及近緣物種品種真實性及純度鑒定等研究[13]。齊冰潔等[8]采用A-PAGE電泳對74份燕麥進行分析，共分離出19種不同的醇溶蛋白帶紋，73種醇溶蛋白圖譜，揭示其存在豐富的等位變異。羅桂花等[14]采用醇溶蛋白電泳分析了42份青海燕麥農(nóng)家品種，其中包括29份皮燕麥，13份裸燕麥，共檢測出6條遷移率不同的譜帶，5種電泳圖譜類型，其變異類型較少，可能與其均來自青海地區(qū)有關(guān)。劉敏軒等[15]采用醇溶蛋白超薄層等電聚焦電泳技術(shù)分析了7個飼用燕麥品種，共分離出34條不同遷移率的譜帶，其中85%的具有多態(tài)性，并成功分離鑒定了7個燕麥品種及其純度。本研究采用A-PAGE電泳對15個品種進行分析，共檢測到18條不同的醇溶蛋白位點，其多態(tài)性達到100%，存在14種圖譜類型，成功分離鑒定出13個品種。這些結(jié)果表明，醇溶蛋白電泳能夠作為一種簡單、快速、有效的手段進行燕麥品種真實性及純度的鑒定。

聚類分析結(jié)果表明，二倍體栽培燕麥類型砂燕麥與其他六倍體栽培燕麥的遺傳關(guān)系較遠，分化非常明顯。而供試材料中的皮燕麥和裸燕麥的分化反而不是很明顯，如青莜3號裸燕麥與林納皮燕麥親緣關(guān)系更近，青引3號與加燕2號親緣關(guān)系相對更近。這也表明在燕麥種質(zhì)等研究中，倍性對燕麥種質(zhì)特性的影響更為明顯，這在不同倍性燕麥的抗旱性評價中得到了印證[16]。在六倍體栽培燕麥中，阿壩和青引1號燕麥也與其他品種間表現(xiàn)出了一定的特異性，在生產(chǎn)上也表現(xiàn)出早熟、高產(chǎn)等特性，可以為后續(xù)的雜交種質(zhì)組配等提供參考。另外，青燕1號、青海444和青海甜燕麥3個品種的親緣關(guān)系較近，特別是青海444與青燕1號的醇溶蛋白帶譜完全一樣，其在種子的外稃上均呈現(xiàn)出黑色。下一步研究將借助SSR等高分辨率的分子標(biāo)記進行進一步的區(qū)分和分子指紋圖譜的構(gòu)建。

4 結(jié) 論

本研究采用A-PAGE電泳對15個飼用燕麥品種的醇溶蛋白進行分析，共擴增出18條帶，多態(tài)性達到100%，結(jié)果揭示了供試品種間具有較大的遺傳變異。聚類分析等結(jié)果表明，砂燕麥、阿壩、青引1號與其他品種親緣關(guān)系較遠，其中青燕1號和青海444的親緣關(guān)系最近。