郭文慧， 潘云， 李艷△

1大理大學基礎(chǔ)醫(yī)學院病理學教研室(云南大理 671000)； 2大理大學附屬醫(yī)院病理科(云南大理 671000)

轉(zhuǎn)移是大多數(shù)癌癥患者預后不良和癌癥相關(guān)性死亡的主要原因,是由Ashworth[1]首次提出的循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)離開原發(fā)和(或)繼發(fā)腫瘤微環(huán)境，并滲入循環(huán)系統(tǒng)和淋巴系統(tǒng)而引起，所以針對CTCs的檢測和治療受到了研究者的廣泛關(guān)注。但因CTCs富集技術(shù)的缺乏，其應用一直受到限制。直到近20年間，隨著CTCs分離純化技術(shù)的不斷發(fā)展和成熟，其潛在臨床應用才逐漸被發(fā)掘出來。近年來，大量研究已表明CTCs檢測可用于輔助癌癥的早期診斷、預測預后及監(jiān)測復發(fā)和轉(zhuǎn)移，可很好地反映腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復發(fā)等情況。美國FDA已批準使用CellSearch計數(shù)CTCs作為監(jiān)測轉(zhuǎn)移性乳腺癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌無進展生存期(progression free survival，PFS)和總生存期(overall survival，OS)的預后生物標志物。還有研究也表明CTCs分析可用于檢測各種癌癥的早期腫瘤進展，如乳腺癌、結(jié)腸直腸癌和前列腺癌等[2-5]。但CTCs在癌癥治療中的研究，國內(nèi)已報道的綜述文獻大多是關(guān)于CTCs計數(shù)對治療療效的監(jiān)測評估，本文就CTCs的分子分析和靶向CTCs兩方面對癌癥治療的研究進展作一綜述，其主要內(nèi)容為：通過追蹤CTCs的分子生物學變化，揭示重要的抗腫瘤藥物敏感性信息和耐藥情況，在個性化基礎(chǔ)上，實現(xiàn)治療方案的迅速調(diào)整；通過靶向轉(zhuǎn)移過程中CTCs，干擾腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移或影響CTCs回巢后的腫瘤生長，改善患者預后或減少轉(zhuǎn)移相關(guān)性癌癥死亡，為下一代癌癥患者抗轉(zhuǎn)移治療的發(fā)展提供可能。

1 CTCs指導個體化醫(yī)療

傳統(tǒng)活檢和影像成像是診斷腫瘤最常用的方法，一直以來，治療方案的選擇都脫離不了實體腫瘤病灶檢查的局限性[6]。但CTCs作為腫瘤轉(zhuǎn)移的“種子”，存在于血液循環(huán)系統(tǒng)中，可被簡便、微創(chuàng)和可重復性地檢查，解決了以上局限。另外，常常在治療初期各抗腫瘤藥物的療效較好，可最終大部分腫瘤產(chǎn)生了耐藥性，而耐藥突變的出現(xiàn)往往造成患者的預后不良。CTCs分析的發(fā)展，可通過檢測CTCs的DNA、RNA和蛋白質(zhì)組分實時監(jiān)測腫瘤進展，為針對腫瘤產(chǎn)生的新突變和隨之產(chǎn)生的耐藥性，確定最有效的治療方案。再者，近年來隨著CTCs體內(nèi)外細胞培養(yǎng)技術(shù)的不斷發(fā)展，使基于CTCs的藥敏實驗成為可能，從而大大提高了治療方案的有效性。

1.1 通過檢測CTCs的分子生物學特性制定和調(diào)整治療方案 曲妥珠單抗作為乳腺癌患者的靶向藥物，目前，只是HER-2擴增型乳腺癌標準治療的部分，但從CTCs分子分析的角度來看，原發(fā)性HER-2陰性乳腺癌也可能從中受益。大量研究表明，在原發(fā)性HER-2陰性乳腺癌患者中，可檢測到HER-2陽性的CTCs[7-8]。2期臨床試驗就以CTCs HER-2基因擴增為依據(jù)，對原發(fā)性HER-2陰性的乳腺癌患者進行實驗性曲妥珠單抗治療，發(fā)現(xiàn)其可延長此類患者的PFS[9]。前瞻性3期臨床試驗正在進行，設(shè)置標準治療組和標準治療聯(lián)合拉帕替尼(HER-2蛋白酪氨酸激酶抑制劑)治療組，來探討原發(fā)性HER-2陰性、CTCs HER-2陽性乳腺癌患者能否從抗HER-2治療中獲益[10]。如果可以，則CTCs HER-2的基因或蛋白分子檢測就可為乳腺癌的患者提供更全面的治療策略。除HER-2外，Mazel等[11]首次在乳腺癌的CTCs中檢查到細胞程式死亡-1(PD-L1)，此為腫瘤免疫治療的靶點，可為患者選擇免疫療法，并在免疫治療期間實現(xiàn)實時監(jiān)測。Paoletti等[12]也通過監(jiān)測CTCs中ER的基因及表達情況，來作為乳腺癌內(nèi)分泌治療的工具。

吉非替尼是非小細胞肺癌(NSCLC)的一線靶向藥物，可選擇性抑制表皮生長因子受體(EGFR)酪氨酸激酶。目前，研究發(fā)現(xiàn)吉非替尼耐藥的NSCLC中有50%歸因于EGFR T790M突變[13]。Jiang等[14]在NSCLC患者的原發(fā)組織和CTCs中測定了EGFR的特定突變位點：19-Del、L858R、T790M、20-Ins、G719X、S768I和L861Q，發(fā)現(xiàn)兩者中EGFR的突變幾乎一致，且發(fā)現(xiàn)吉非替尼治療有效或成功的患者，CTCs EGFR中無T790M突變，而耐藥患者CTCs中可檢出T790M突變。此實驗揭示了CTCs檢測可代替原發(fā)組織活檢，通過測定CTCs EGFR突變，可及時調(diào)整靶向治療方案，避免無效治療。除EGFR亞型外，間變性淋巴瘤激酶(ALK)重排是NSCLC的又一不同亞型。Kim等[15]使用熒光原位雜交技術(shù)(FISH)檢測了ALK重排NSCLC患者中的CTCs，發(fā)現(xiàn)分析CTCs中的ALK重排可能是預測ALK抑制劑克唑替尼耐藥性和選擇色瑞替尼(克唑替尼耐藥患者的ALK抑制劑)治療的有用方法。Ilié等[16]研究了CTCs和循環(huán)白細胞中的PD-L1狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)與腫瘤組織中的PD-L1狀態(tài)相關(guān)，揭示了連續(xù)CTCs監(jiān)測在腫瘤免疫療法選擇中的重要作用。

除以上介紹的乳腺癌和NSCLC外，CTCs的分子生物學特性檢測在其他癌癥中也有類似的作用。如在卵巢癌的鉑類耐藥患者中，外周CTCs中可檢出一組與化療耐藥相關(guān)的蛋白，即多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance-related proteins 1～10，MRP 1～10)和核糖核苷酸還原酶亞基 M1(ribonucleotide reductase subunit M1，RRM1)，這組蛋白可為治療耐藥性卵巢癌提供前景靶點[17]。再者，Braun等[18]首次證實了EGFR蛋白在肉瘤患者CTCs中的表達，表明了可通過隨訪CTCs中EGFR的表達情況來評估靶向EGFR治療的療效，為疾病過程中及時調(diào)整患者的治療方案做準備。

1.2 通過CTCs細胞培養(yǎng)的藥敏測試 研究表明，在乳腺癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌和肺癌中已經(jīng)建立了CTCs細胞系[19-22]，且有些亞型可以在小鼠的臨床實驗中致瘤。2014年，Yu等[20]報道了一項具有里程碑意義的研究，他們在6例患有ER陽性乳腺癌的患者中分離出CTCs，通過體外懸浮培養(yǎng)，建立了CTCs細胞系和小鼠原位移植瘤模型。又采用體外細胞培養(yǎng)藥敏試驗和DNA二代測序，證實了CTCs中PIK3CA突變者對BYL719敏感，F(xiàn)GFR2突變者對AZD4547敏感，ESR1突變者對他莫昔芬及氟維司群均耐藥，但聯(lián)合HSP90抑制劑則可取得很好的效果。此結(jié)果揭示了乳腺癌藥物敏感性與CTCs 基因突變的相關(guān)性，可以幫助鑒定個體乳腺癌患者在其疾病過程中的最佳療法。2015年，Cayrefourcq等[21]成功培育出結(jié)直腸癌CTCs的第1株永久細胞株，且在免疫缺陷小鼠中形成了異種移植腫瘤，為進一步體內(nèi)外進行大量藥敏測試的功能研究提供了條件，將更好地實現(xiàn)個體化精準醫(yī)療。另外，Zhang等[23]利用芯片捕獲的肝癌CTCs在三維細胞培養(yǎng)試驗中擴增形成了球狀結(jié)構(gòu)，且在藥敏測試中發(fā)現(xiàn)了索拉非尼或奧沙利鉑可顯著地抑制CTCs的克隆。此外，在一項預測和評估紫杉醇-卡鉑治療上皮性卵巢癌療效的研究中，研究者利用體外培養(yǎng)CTCs測試藥敏來評估CTCs對紫杉醇-卡鉑的敏感度與患者療效反應之間的相關(guān)性。根據(jù)患者的治療史和隨訪可知，當CTCs對紫杉醇-卡鉑敏感時，患者病情緩解或?qū)熡蟹磻欢擟TCs對紫杉醇-卡鉑耐藥時，患者復發(fā)[24]。此實驗表明可通過體外CTCs的藥敏實驗來評估療效并及時為疾病過程中的個體患者更換療法。

2 針對CTCs的癌癥治療方法

CTCs處在整個轉(zhuǎn)移擴散過程的中心環(huán)節(jié)上，若將其作為一個新靶點，可干擾癌癥的轉(zhuǎn)移，為癌癥治療提供新方案。

2.1 靶向清除CTCs 自然殺傷細胞表面的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)可以誘導腫瘤細胞的凋亡，這是機體對腫瘤發(fā)生的重要免疫手段。通過把TRAIL修飾的脂質(zhì)體整合到與CTCs結(jié)合的循環(huán)細胞和血液成分中，從而誘導CTCs的凋亡是一種腫瘤治療的新嘗試。Wayne等[25]把修飾的脂質(zhì)體附著到循環(huán)白細胞上，使這些白細胞變成循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的“非自然殺傷細胞”，誘導它們接觸的CTCs發(fā)生凋亡。Li等[26]通過同樣的方法，依據(jù)CTCs與血小板的相互作用，建立了血小板靶向脂質(zhì)體。他們通過功能化轉(zhuǎn)移性乳腺癌模型小鼠中的血小板以清除CTCs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血小板上表達TRAIL的小鼠肺轉(zhuǎn)移明顯減少。同樣地，Chandrasekaran等[27]創(chuàng)建了TRAIL修飾的NK細胞脂質(zhì)體，以增強NK細胞的內(nèi)在腫瘤抑制能力，使NK細胞對CTCs的殺傷力增強，并有效地防止原發(fā)性腫瘤的轉(zhuǎn)移性擴散。

最近的研究發(fā)現(xiàn)，納米激光探針可檢測和追蹤循環(huán)中的CTCs，并可通過發(fā)射高功率激光脈沖殺滅CTCs，但不會對正常細胞造成破壞，這可有效控制癌癥轉(zhuǎn)移，有望成為減少轉(zhuǎn)移相關(guān)性癌癥死亡的前景手段[28]。然而，這種創(chuàng)新方法的可行性和安全性，還需要未來臨床試驗的證明。特別是，評估殺死轉(zhuǎn)運CTCs是否對已建立的臨床結(jié)果參數(shù)，如PFS和OS有影響?？梢栽O(shè)想，對于不可手術(shù)但沒有總轉(zhuǎn)移跡象的癌癥患者來說，殺滅CTCs、停止進一步血液播散可能會使其受益。另外，Mirza等[29]的研究也表明，姜黃素可通過誘導DNA損傷或抑制DNA修復靶向循環(huán)肺癌干細胞，從而減緩NSCLC的疾病進展和轉(zhuǎn)移。

2.2 通過CTCs殺死原發(fā)和轉(zhuǎn)移腫瘤細胞 最近的研究表明，CTCs可以從原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性病灶轉(zhuǎn)移到外周血，然后通過稱為“自我播種”的過程回到原發(fā)腫瘤或繼發(fā)腫瘤，從而促進原發(fā)性腫瘤生長和繼發(fā)性轉(zhuǎn)移性傳播[30]。Dondossola等[31]利用了這種生物學屬性，將腫瘤壞死因子-α(TNF-α)通過CTCs直接傳遞給原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤，來實現(xiàn)“腫瘤自我靶向”。他們通過基因工程的設(shè)計，使從乳腺癌、黑素瘤和Lewis肺癌小鼠中提取的CTCs表達TNF-α，然后回輸?shù)叫∈篌w內(nèi)，在一系列干預試驗后，觀察到CTCs可以定位到腫瘤上，且在表達TNF-α的腫瘤細胞小鼠中發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性腫瘤灶和轉(zhuǎn)移性集落的生長有所減緩或減少。此實驗雖然在其他許多腫瘤模型中還未進行過測試，但也給以CTCs為中介的癌癥治療帶來了曙光。

3 展望

以上主要論述了CTCs分析在個體化醫(yī)療中的貢獻，以及CTCs作為靶點在癌癥治療中的潛力。未來該領(lǐng)域的發(fā)展，需要改善培養(yǎng)環(huán)境來體外培養(yǎng)各種腫瘤CTCs，實現(xiàn)CTCs高通量基因突變分析，建立CTCs亞型的轉(zhuǎn)移性動物模型，為克服耐藥性、推定新藥療效及早期臨床試驗機制提供證據(jù)，為藥物干擾轉(zhuǎn)移試驗提供實驗對象，潛在地推動轉(zhuǎn)移過程中的癌癥治療的進一步發(fā)展。除此以外，CTCs在臨床早期診斷中的作用也是一大熱點，尤其是腫瘤的定位診斷。眾所周知，現(xiàn)有CTCs的化學富集是通過一些在血細胞中不表達，但在腫瘤細胞上陽性表達的上皮細胞表型來實現(xiàn)，但卻不能鑒定所捕獲CTCs的組織與器官來源。Lu等[32]把常規(guī)用來鑒定特定腫瘤起源的不同種類標記物，應用于CTCs表征，將從肺癌、結(jié)腸直腸癌和前列腺癌外周血中捕獲的CTCs洗脫至由6組抗體組成的免疫熒光染色組：anti-panCK、anti-CK18、anti-CK7、anti-TTF-1、anti-CK20/anti-CDX2、and anti-PSA/anti-PSMA。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CK7+或TTF-1+、CK20/CDX2+和PSA/PSMA+的CTCs分別對應于肺癌、結(jié)腸直腸癌或前列腺癌，給早期確診腫瘤原發(fā)灶帶來了新的可能。未來可在此基礎(chǔ)上發(fā)展敏感度、特異度高的技術(shù)方法，來實現(xiàn)早期、精準診斷腫瘤，提高患者的治愈率及降低病死率。