黃秋艷 楊一華 譚 瑩 劉 博 覃愛(ài)平

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖中心，南寧市 530021，電子郵箱：445642639@qq.com)

【提要】 卵巢早衰的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，從根本上修復(fù)卵巢早衰患者的卵巢功能，解決其生育問(wèn)題是生殖醫(yī)學(xué)的難點(diǎn)。近年來(lái)，有學(xué)者嘗試使用細(xì)胞療法治療卵巢早衰，取得一定的效果。本文就卵巢早衰相關(guān)細(xì)胞療法的種類、機(jī)制、效果及存在的問(wèn)題進(jìn)行綜述。

卵巢早衰指女性在40歲前發(fā)生卵巢功能衰竭，出現(xiàn)原發(fā)性或者繼發(fā)性閉經(jīng)，伴有促性腺激素水平升高和雌激素水平降低，以及圍絕經(jīng)期表現(xiàn)等[1]，被認(rèn)為是早發(fā)性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)中病情最嚴(yán)重的亞型[2]。全球40歲以下的女性人群中，約1%受卵巢早衰困擾[2-3]。卵巢早衰是導(dǎo)致女性不孕的重要疾病之一，其病因包括染色體異常、放化療損傷、卵巢手術(shù)操作史、代謝異常、免疫調(diào)節(jié)異常、氧化應(yīng)激、環(huán)境因素等[1，4-5]，目前最常見(jiàn)的治療方法為補(bǔ)充激素治療[1]，但是該方法無(wú)法解決患者的生育問(wèn)題，還導(dǎo)致部分患者乳腺癌等疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加[6]。其他方法包括心理支持、脫氫表雄酮、輔酶Q、褪黑素、免疫治療以及改善生活方式等，但均不能從根本上修復(fù)卵巢功能，常需要借助贈(zèng)卵來(lái)解決患者生育問(wèn)題[5]。近年來(lái)，有學(xué)者使用以干細(xì)胞為核心的細(xì)胞療法治療卵巢早衰及POI，取得一定療效[7-8]，包括間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell,MSC)、人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(human induced pluripotent stem cell,hiPSC)、卵巢生殖干細(xì)胞(ovarian germline stem cell,OGSC)、胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell,ESC)以及單核細(xì)胞等。本文就相關(guān)細(xì)胞療法治療卵巢早衰的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 MSC

MSC是來(lái)源于中胚層中具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，最早被發(fā)現(xiàn)于骨髓中[9]，其具有多向分化、造血支持、低免疫原性、旁分泌及“歸巢”等特點(diǎn)[10]，可誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞等[9]。MSC治療卵巢早衰的機(jī)制主要有：(1)在添加各類生長(zhǎng)因子例如視黃酸、骨形態(tài)發(fā)生蛋白4、骨形態(tài)發(fā)生蛋白8b及轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子β1共培養(yǎng)條件下，MSC可分化成生殖樣細(xì)胞[7]。研究發(fā)現(xiàn)，移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMMSC)可歸巢至受損部位，其可分化成為新的顆粒細(xì)胞或者具有分泌營(yíng)養(yǎng)功能的生殖細(xì)胞，而不是卵母細(xì)胞[8]，但是MSC可能參與了卵母細(xì)胞的修復(fù)和合成[11]；(2)MSC通過(guò)上調(diào)B淋巴細(xì)胞瘤2[12]，下調(diào)B淋巴細(xì)胞瘤2相關(guān)X蛋白、半胱氨酸蛋白酶3[12-13]和半胱氨酸蛋白酶9[14]的表達(dá)，減少顆粒細(xì)胞的凋亡；(3)MSC旁分泌各種細(xì)胞生長(zhǎng)因子如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子1、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β等，與細(xì)胞的存活、增殖、遷移以及血管的形成等有關(guān)[8，12，15-16]；(4)MSC可促進(jìn)調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的分化而在免疫抑制中發(fā)揮重要作用[17]；(6)MSC有助于卵巢抗氧化、抗纖維化[8，16]。研究表明，MSC具有向損傷組織遷移并定植(即“歸巢”)的特點(diǎn)，“歸巢”后可修復(fù)組織功能[11，18-19]，靜脈注射和卵巢原位注射MSC均能修復(fù)卵巢早衰所致的內(nèi)分泌紊亂[11，20]。目前用于治療卵巢早衰的MSC細(xì)胞主要有以下幾類。

1.1 BMMSC BMMSC來(lái)源于骨髓內(nèi)，是最早發(fā)現(xiàn)的MSC[9，21]。BMMSC具有良好的分化性能及低免疫原性，采集便利，目前將其用于促進(jìn)生育力恢復(fù)的研究較多[7-8]，且其在卵巢早衰的治療中取得較好效果[8]。Edessy等[22]報(bào)告，一名染色體異常所致卵巢早衰患者接受BMMSC卵巢體內(nèi)移植后成功妊娠。但也有研究顯示，隨著年齡增長(zhǎng)，BMMSC的細(xì)胞數(shù)量和擴(kuò)增分化能力呈下降趨勢(shì)[21]，且骨髓穿刺為有創(chuàng)性操作，會(huì)增加患者疼痛、感染等風(fēng)險(xiǎn)。

1.2 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 臍帶血內(nèi)含有胎兒生長(zhǎng)發(fā)育期間產(chǎn)生的多種未成熟細(xì)胞，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cell，HUC-MSC)主要來(lái)源于臍帶組織或臍帶血，取材方便，對(duì)供者無(wú)不利影響，便于保存，道德倫理限制性小，且與輸注干細(xì)胞相關(guān)的病毒和病原微生物感染率遠(yuǎn)低于BMMSC[13]。HUC-MSC低表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ，不表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ，因此具有低免疫原性[23]。孫海翔等[24]將HUC-MSC移植入6例卵巢早衰患者，其中有1例在術(shù)后1個(gè)月開(kāi)始恢復(fù)排卵，并自然受孕分娩1名健康嬰兒。

1.3 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞 脂肪組織具有來(lái)源豐富、取材損傷小、低免疫原性、穩(wěn)定增殖等優(yōu)點(diǎn)[25]。多項(xiàng)卵巢早衰動(dòng)物模型研究證實(shí)，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞治療卵巢早衰的效果較好[11，26-27]。體外研究表明，人源脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合雌激素可促進(jìn)POI患者外周血中調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的分化[28]。Fang等[29]研究報(bào)道，將自體脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)陰道腹腔鏡注入4例卵巢早衰患者卵巢中，術(shù)后有2例患者恢復(fù)排卵，尿促卵泡素下降，雌二醇升高。

1.4 月經(jīng)血來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞 月經(jīng)血收集方便且無(wú)創(chuàng)，月經(jīng)血來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞具有與其他MSC一樣的特性，包括自我更新、高增殖率和多分化能力[30]。部分動(dòng)物研究證實(shí)，月經(jīng)血來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞可促進(jìn)卵巢早衰模型動(dòng)物卵巢功能的恢復(fù)[16，31]。但因月經(jīng)血采集多為供體自行采集，陰道解剖環(huán)境的特點(diǎn)增加了月經(jīng)血來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞制備過(guò)程中的生物污染風(fēng)險(xiǎn)。目前相關(guān)的研究主要集中在動(dòng)物研究，尚未見(jiàn)相關(guān)臨床研究報(bào)道。

1.5 其他來(lái)源MSC 其他來(lái)源的MSC如人胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞[17，19]、人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞[32]、皮膚間充質(zhì)干細(xì)胞[33]等，移植后均有助于卵巢早衰動(dòng)物模型卵巢功能的恢復(fù)，但均未進(jìn)入臨床相關(guān)研究。

2 單核細(xì)胞

單核細(xì)胞富含造血干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞等，有助于組織再生，可用于組織器官再生及修復(fù)、促進(jìn)血管新生、改善局部微環(huán)境及內(nèi)分泌組織的功能等[34-35]。研究表明，單核細(xì)胞有助于卵泡再生，可誘導(dǎo)新的卵巢生殖細(xì)胞發(fā)展至減數(shù)分裂階段及形成顆粒細(xì)胞[36]。臨床研究中，MSC需體外擴(kuò)增培養(yǎng)或通過(guò)特殊細(xì)胞分子標(biāo)志物，借助免疫磁珠、流式細(xì)胞分選等萃取[9]；而單核細(xì)胞制備快捷，無(wú)須體外擴(kuò)增，能實(shí)現(xiàn)自體移植，臨床應(yīng)用及推廣空間較大，近年來(lái)相關(guān)研究亦較多，包括應(yīng)用于缺氧性腦癱[37]、缺血性心臟疾病[38]、肢體缺血[39]等。

2.1 骨髓單核細(xì)胞 骨髓單核細(xì)胞又稱為骨髓源干細(xì)胞(bone marrow-derived stem cell，BMDSC)，一般采用Ficoll分離液等自骨髓液分離制備。動(dòng)物研究顯示，將BMDSC經(jīng)尾靜脈注入化療所致卵巢早衰的小鼠體內(nèi)，可產(chǎn)生不成熟的卵泡[40]。Herraiz等[41]將粒細(xì)胞集落刺激因子動(dòng)員后的人源性BMDSC注入卵巢早衰小鼠的卵巢組織，可產(chǎn)生高質(zhì)量的排卵前卵泡、二級(jí)優(yōu)胚、2細(xì)胞胚胎以及健康的子代。有研究報(bào)道，一名45歲POI患者經(jīng)腹腔鏡下移植自體BMDSC，術(shù)后2個(gè)月恢復(fù)自然排卵，行體外受精-胚胎移植后成功妊娠并分娩一名健康男嬰[35]。

2.2 外周血單核細(xì)胞 外周血單核細(xì)胞由外周血分離提取，正常外周血中含有極少量的干細(xì)胞，粒細(xì)胞集落刺激因子可將骨髓內(nèi)祖細(xì)胞動(dòng)員至外周血循環(huán)中[42]，動(dòng)員后采集的外周血單核細(xì)胞內(nèi)含有造血干細(xì)胞、MSC、內(nèi)皮祖細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等[34]。El Andaloussi等[43]將粒細(xì)胞集落刺激因子動(dòng)員的外周血單核細(xì)胞經(jīng)靜脈輸注入卵巢早衰小鼠后，小鼠體內(nèi)與卵巢修復(fù)相關(guān)的標(biāo)志物CD34、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等表達(dá)上調(diào)，動(dòng)情周期改善、卵泡發(fā)育增多，生育力恢復(fù)且產(chǎn)仔數(shù)量明顯增加，與BMDSC作用類似。本課題組前期研究顯示，粒細(xì)胞集落刺激因子動(dòng)員的外周血單核細(xì)胞經(jīng)卵巢注射移植入POI大鼠，可使大鼠顆粒細(xì)胞的凋亡減少，卵巢血管新生增加，竇前卵泡發(fā)育增多，有助于卵巢功能恢復(fù)[44]。

2.3 臍帶血單核細(xì)胞 臍帶血富含多種未成熟細(xì)胞[13]。Dang等[45]將人源臍帶血單核細(xì)胞成功移植入卵巢早衰裸鼠的卵巢中，4周后觀察到小鼠卵泡增多，性激素水平改善，卵巢功能恢復(fù)，但是臍帶血單核細(xì)胞含有的細(xì)胞成分較多，異體移植免疫排斥反應(yīng)大。

3 hiPSC

hiPSC與ESC具有相似的多向分化潛能。Liu等[46]采用多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子和雌激素誘導(dǎo)hiPSC體外分化為卵巢顆粒樣細(xì)胞，然后移植入卵巢早衰小鼠，其可以促進(jìn)卵巢組織的修復(fù)及卵泡的發(fā)育。hiPSC需要在體外擴(kuò)增培養(yǎng)、添加誘導(dǎo)因子等，目前臨床上將hiPSC用于治療卵巢早衰的研究較少。

4 OGSC

在小鼠、大鼠、人類中均存在OGSC[47]。Wu等[48]用免疫磁珠法提取5日齡小鼠的OGSC并移植入卵巢早衰小鼠的卵巢中，觀察到供體的OGSC歸巢到卵巢皮質(zhì)邊緣后分化為早期卵母細(xì)胞，隨后產(chǎn)生修復(fù)卵巢功能的作用，最終恢復(fù)懷孕并產(chǎn)下健康的子代。關(guān)于OGSC的相關(guān)研究結(jié)果顛覆了既往傳統(tǒng)的卵巢內(nèi)無(wú)生殖干細(xì)胞的觀點(diǎn)，但目前相關(guān)研究仍較少，今后還需進(jìn)一步研究探討。

5 ESC

因倫理爭(zhēng)議較大，近年來(lái)卵巢早衰與ESC相關(guān)的研究相對(duì)較少。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)羊水間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)ESC的標(biāo)志物(八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4)，且羊水間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖速度比MSC快，將羊水間充質(zhì)干細(xì)胞移植入卵巢早衰小鼠可減少顆粒細(xì)胞的凋亡[49]。羊膜表皮細(xì)胞亦可通過(guò)旁分泌等改善卵巢功能[50]。羊水間充質(zhì)干細(xì)胞和羊膜表皮細(xì)胞的倫理限制相對(duì)較小，但是與羊膜間充質(zhì)細(xì)胞相比，羊膜表皮細(xì)胞更易引起免疫排斥反應(yīng)，且其改善卵巢功能的效果不如羊膜間充質(zhì)細(xì)胞明顯[32]。

6 小 結(jié)

目前卵巢早衰的各類細(xì)胞療法的治療仍集中在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，其在臨床研究中取得的成果有限，更多的研究還在探索中。目前已報(bào)道的研究中，未出現(xiàn)不良反應(yīng)及安全問(wèn)題報(bào)道，經(jīng)細(xì)胞療法治療后所生育的子代亦未見(jiàn)畸形及其他不良影響報(bào)道，但是今后的卵巢早衰細(xì)胞療法仍需關(guān)注以下問(wèn)題：(1)目前仍缺乏細(xì)胞療法的計(jì)數(shù)、使用劑量、細(xì)胞活力檢測(cè)、使用途徑的優(yōu)化研究，各類臨床試驗(yàn)的劑量迥異，未來(lái)可嘗試選擇采集更方便、效果更優(yōu)的細(xì)胞治療方法，以及更高效的干預(yù)方法等；(2)免疫排斥反應(yīng)，異體細(xì)胞移植排斥反應(yīng)大，自體細(xì)胞移植能最大限度減少排斥反應(yīng)的發(fā)生[8]；(3)保存一定數(shù)量的細(xì)胞且具有較高的細(xì)胞活力是細(xì)胞治療成功的關(guān)鍵，在臨床實(shí)踐中需探索如何減少制備時(shí)細(xì)胞的損耗、污染以及其他可能影響細(xì)胞活力的因素；(4)現(xiàn)有的各項(xiàng)研究多為小樣本、分散的研究，觀察周期較短，今后細(xì)胞治療卵巢早衰的進(jìn)一步推廣及應(yīng)用需更大樣本以及更長(zhǎng)時(shí)間的研究數(shù)據(jù)支持。