何文濤，謝洪霞

（1.甘肅省張掖中學(xué)，甘肅 張掖 734000；2.蘭州市漁業(yè)技術(shù)推廣中心，甘肅 蘭州 730050）

赤皮病又稱出血性腐敗病，赤皮瘟、擦皮瘟等，已成為嚴(yán)重影響水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的細(xì)菌性疾病之一。研究表明，大鯢赤皮病的病原菌為熒光假單胞菌[1,2]。2010年，鄧顯文等[3]從發(fā)病的羅非魚體內(nèi)分離一株革蘭氏陰性細(xì)菌，確定出赤皮病病原為熒光假單胞桿菌。沈曉靜等[4]又從發(fā)病錦鯉體內(nèi)分離出熒光假單胞桿菌。感染赤皮病的病魚體表局部或大部分出血發(fā)炎，鱗片脫落，特別是魚體兩側(cè)和腹部最為明顯[4]。病魚行動(dòng)緩慢，反應(yīng)遲鈍，獨(dú)游于水面，在鱗片脫落和鰭條腐爛處往往出現(xiàn)水霉菌寄生[3]。

1 材料與方法

1.1 材料

IHNV病料（肝臟、胰臟），從甘肅省永登縣某虹鱒養(yǎng)殖場采集。

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，購自QIAGEN 公 司；DNA Marker、pMD-19T，T4 DNA連接酶、Ex Taq酶，購自TaKaRa生物科技有限公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，購自O(shè)MEGA公司；PCR引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離鑒定 在無菌工作臺(tái)中取病魚的肝臟、脾臟等病變組織，接種于血平板上，置于培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)18～24 h。挑取單個(gè)菌落至液體培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)18～24 h，將液體培養(yǎng)物劃線接種到血平板置于培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)18～24 h，挑取單個(gè)菌落劃線于血平板培養(yǎng)18～24 h得到純菌種。于4 ℃保藏備用。純化的細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色，置于顯微鏡下進(jìn)行細(xì)菌菌體觀察。

1.2.2 16S rRNA基因克隆及序列分析 參照黃文明等[7]的方法進(jìn)行。引物序列如下：

以提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為：Ex Taq酶25 μL，上游引物1.5μL，下游引物1.5 μL，待檢樣品4 μL，加入滅菌ddH2O 18 μL至總體積為50 μL。PCR反應(yīng)條件 ：98 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30s，60 ℃退火40 s，70 ℃延伸1 min，共31個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2 %瓊脂糖凝膠電泳，然后在紫外燈下用滅菌手術(shù)刀切取含相應(yīng)DNA片段的凝膠，再用DNA膠回收試劑盒進(jìn)行回收。回收的PCR產(chǎn)物與pMD-19T載體連接，連接體系：PCR產(chǎn)物5 μL，pMD19-T 2 μL，5×T4 DNA 連 接 緩沖液2 μL，T4 DNA連接酶1 μL，混勻后置于4 ℃連接過夜。之后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。將鑒定為陽性的質(zhì)粒，用質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取，然后送往蘇州金唯智生物科技有限公司測序。將測序結(jié)果置于NCBI上進(jìn)行基因的同源性比對并分析，并用MEGA 7.0做系統(tǒng)進(jìn)化樹，對進(jìn)化關(guān)系做進(jìn)一步分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌形態(tài)學(xué)特征

由發(fā)病虹鱒肝臟、脾臟等病變組織分離純化獲得1株細(xì)菌，編號(hào)為GS株，在血平板上呈圓形、半透明、光滑、中央呈黃色，向四周顏色逐漸變淡。GS株革蘭氏染色陰性，菌體短桿狀、兩端鈍圓、無芽孢（如圖1所示）。

圖1 GS株菌落及菌體形態(tài)

2.2 16S rRNA基因克隆及序列分析

采用PCR方法克隆GS株的16S rRNA基因，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，分別可見擴(kuò)增大小約為1 500 bp目的條帶（如圖2所示）。將提取的重組克隆載體測序，序列分析結(jié)果顯示，目的片段為1 430 bp，與Genbank上已經(jīng)發(fā)表的熒光假單胞桿菌代表菌株A11株、PFDWD株基因相對區(qū)域的核苷酸序列進(jìn)行比較，同源性分別為99%、99%。選用9個(gè)熒光假單胞菌屬標(biāo)準(zhǔn)參考菌株，使用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析如圖3所示，分離菌株GS株與代表性菌株A11株、PFDWD株的遺傳關(guān)系較近。

圖2 GS株基因擴(kuò)增結(jié)果

圖3 GS株16S rRNA基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

熒光假單胞菌為魚類條件致病菌之一，常引起羅非魚、鯉魚，大西洋鮭、大鯢和虹鱒等多種水產(chǎn)動(dòng)物赤皮病，造成飲用水、食物污染，導(dǎo)致人類呼吸、消化系統(tǒng)感染。目前通常用于熒光假單胞桿菌檢測的方法為PCR方法[5]、擴(kuò)增性rDNA酶切分析法[6]等診斷方法。本研究從暴發(fā)疫情的虹鱒肝臟、脾臟等病變器官中分離純化出菌株GS株，經(jīng)16S rRNA基因克隆測序和序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，最終鑒定為熒光假單胞桿菌。本試驗(yàn)將傳統(tǒng)細(xì)菌分離純化的方法與分子生物學(xué)的方法相結(jié)合，準(zhǔn)確分離診斷出了甘肅省永登地區(qū)爆發(fā)疫情的疫病為赤皮病，病原為熒光假單胞桿菌。該分離鑒定方法的建立，為該地區(qū)赤皮病的快速精確診斷提供了理論依據(jù)，為甘肅省永登地區(qū)赤皮病的防治提供了參考。