非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指無過量飲酒史和其他明確的肝損傷因素、以肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征，包括輕度脂肪變性、非酒精性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和伴纖維化的小葉壞死性炎性反應(yīng)。NASH可進展成肝硬化、門靜脈高壓、肝衰竭甚至肝細(xì)胞癌(HCC)[1]。目前NAFLD被認(rèn)為是疾病晚期肝衰竭的主要危險因素，預(yù)計到2020年其將成為美國肝移植的首要病因[2]。NAFLD的病因尚未完全闡明，其發(fā)病機制學(xué)說已由經(jīng)典的“二次打擊”學(xué)說發(fā)展為“多次打擊”學(xué)說。近年來，生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點細(xì)胞外囊泡(EV)引起了學(xué)者們的關(guān)注，其被認(rèn)為是真核生物和原核生物細(xì)胞間通訊的有力工具[3]。

1 EV的概述

1.1 EV的定義與分類

20世紀(jì)下半葉，細(xì)胞外囊泡(EV)被認(rèn)為是細(xì)胞降解時從細(xì)胞膜脫落的無關(guān)緊要的副產(chǎn)品。然而，近幾十年的研究發(fā)現(xiàn)，EV是生理和病理條件下細(xì)胞間通訊的重要媒介[4]。EV是由脂質(zhì)雙分子層包裹的細(xì)胞衍生囊泡，直徑在30～2 000 nm。按細(xì)胞起源和生物學(xué)功能分類，EV又可以分為外泌體、微泡和凋亡小體。外泌體直徑一般為40～120 nm，起源于內(nèi)溶酶體途徑、多泡體的腔內(nèi)出芽以及多泡體與細(xì)胞膜的融合；微泡直徑一般為50～1 000 nm，起源于細(xì)胞表面，由細(xì)胞膜向外萌芽；凋亡小體一般為500～2 000 nm，經(jīng)凋亡細(xì)胞大規(guī)模的質(zhì)膜泡化而成，是細(xì)胞發(fā)生凋亡時伴隨的一種形式[5]。EV作為一種幾乎所有細(xì)胞都可以分泌的生物囊泡狀微小結(jié)構(gòu)，廣泛穩(wěn)定地存在于多種人體體液中，包括血漿、惡性腹水、羊水、尿液和唾液等[6]。EV的內(nèi)容物和膜表面成分均攜帶有來源細(xì)胞的信息，其數(shù)量和內(nèi)容物隨來源細(xì)胞的狀態(tài)和接受的刺激而變化，同一種細(xì)胞在不同狀態(tài)下可釋放出內(nèi)容物完全不同的EV[7]。然而，由于分離方法的技術(shù)有限，導(dǎo)致這些亞型的區(qū)分較為困難。

1.2 EV的組成

EV攜帶各種脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、RNA和DNA，脂質(zhì)組學(xué)分析顯示，囊泡膜上含有豐富的膽固醇、鞘磷脂、神經(jīng)酰胺、飽和脂肪酸、磷脂酰絲氨酸。此外，所有的EV都攜帶一些共同的標(biāo)記蛋白，如熱休克蛋白(HSP70和HSP90)、內(nèi)體特異性的四跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81、CD82)、MVB生物發(fā)生相關(guān)蛋白(Alix 和 TSG101)以及膜運輸和融合蛋白(GTPases、flotillin、annexins)[8-9]。一些供體細(xì)胞的EV也含有獨特的蛋白，如來自B淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的EV包含主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ和Ⅱ分子[10]。除了蛋白質(zhì)外，EV還攜帶大量的信使RNA(mRNA)、DNA、長鏈非編碼RNA(IncRNA)、微RNA(microRNA)[7]。目前認(rèn)為，這些EV攜帶的腫瘤特異性的miRNA或蛋白質(zhì)可作為有臨床應(yīng)用前景的生物標(biāo)志物，用于疾病的診斷并指導(dǎo)治療，如肺癌、前列腺癌、乳腺癌等腫瘤和急性缺血性中風(fēng)、腎臟疾病、阿爾茲海默癥、骨關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病等[11]。

1.3 EV的生理功能

EV的主要生理功能是細(xì)胞間通訊。通過直接膜融合、受體介導(dǎo)的融合或內(nèi)吞作用，EV將攜帶的生物活性物質(zhì)傳遞給受體細(xì)胞，并調(diào)節(jié)受體細(xì)胞功能。由于其表面攜帶多種黏附蛋白，EV可提供一種專有的途徑向治療靶點運送治療藥物。此外，EV可通過其親本細(xì)胞被修飾，在其表面表達或補充靶向部分所需的生物活性[12]。EV這種可以攜帶生物活性分子和定向向靶向器官傳遞的特性，為其成為藥物載體和潛在的治療劑提供了可行性。由免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞產(chǎn)生的EV在免疫調(diào)節(jié)中也起著重要的作用，它們可以介導(dǎo)或抑制免疫反應(yīng)，并誘導(dǎo)炎性反應(yīng)、免疫性疾病和感染性疾病的病理過程。因此，EV也有可能被用作調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的治療劑[13]。

2 EV在NAFLD發(fā)生發(fā)展中的作用

2.1 肝臟分泌EV的特征

肝臟中的大多數(shù)細(xì)胞類型在體外條件下都可以分泌EV，包括肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞(HSC)、竇狀內(nèi)皮細(xì)胞(SEC)、庫普弗細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞)[14]。蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，從原代大鼠肝細(xì)胞衍生的EV中分離出了251種蛋白質(zhì)。除四跨膜蛋白(如CD63、CD81和CD82)、脫唾液酸糖蛋白受體1(ASGR1)外，在肝細(xì)胞衍生的EV中也發(fā)現(xiàn)了肝細(xì)胞特異性受體的富集。肝細(xì)胞來源的EV攜帶參與細(xì)胞內(nèi)通路和解毒的蛋白質(zhì)、細(xì)胞色素的胞質(zhì)蛋白和分泌蛋白(如凝固相關(guān)蛋白和載脂蛋白)。這些發(fā)現(xiàn)表明肝細(xì)胞來源的EV攜帶的蛋白質(zhì)和核酸可以隨細(xì)胞壓力和刺激而改變，即在疾病狀態(tài)下的細(xì)胞和組織相比于正常組，釋放出的EV會有所不同，這使得EV有成為肝臟生物標(biāo)志物的潛力[15]。EV參與了許多肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展，包括丙型肝炎病毒(HCV)感染、乙型肝炎病毒(HBV)感染、HCC、肝纖維化、肝硬化、NAFLD和酒精性肝病(ALD)[16]。

2.2 EV與NAFLD之炎性反應(yīng)

近年來在NAFLD的發(fā)病機制研究中，EV參與細(xì)胞間應(yīng)激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)這一作用被提出。飲食誘導(dǎo)的NASH小鼠血液中可檢測到肝細(xì)胞衍生的EV，并且EV的數(shù)量與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)[17]。動物模型研究發(fā)現(xiàn)，受損肝細(xì)胞來源的外泌體通過激活非實質(zhì)性細(xì)胞(如內(nèi)皮細(xì)胞、HSC、巨噬細(xì)胞)參與了NAFLD的發(fā)展，如多次打擊學(xué)說中血管生成、纖維化、炎性反應(yīng)[17-18]。Heinrich等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，喂食高脂飲食的大鼠血液中EV數(shù)量顯著增加；血漿中衍生的EV可顯著刺激活性氧(ROS)的產(chǎn)生，并誘導(dǎo)原代大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞中血管細(xì)胞黏附分子1(VCAM1)表達，顯示其具有促炎特性。Hirsova等[20]的實驗發(fā)現(xiàn)，溶血性磷脂酰膽堿(LPC)模擬脂毒性誘導(dǎo)人類和小鼠肝細(xì)胞中EV的釋放，發(fā)現(xiàn)這些EV能以一種死亡受體5(DR5)的信號通路激活巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞的配體依賴性激活意味著死亡受體5的配體——腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)存在于脂質(zhì)處理后從肝細(xì)胞釋放的EV中，并作用于巨噬細(xì)胞上的DR5；棕櫚酸鹽處理的肝細(xì)胞釋放的EV上的TRAIL不誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡，而是以受體相互作用蛋白1和核因子-κB(NF-κB)依賴性方式引起炎性反應(yīng)應(yīng)答，這表明脂毒性肝細(xì)胞誘導(dǎo)的EV具有促炎特性。實驗中采用Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶1(ROCK1)抑制劑法舒地爾作用于小鼠肝細(xì)胞，顯著降低了LPC誘導(dǎo)肝細(xì)胞釋放的EV數(shù)量。這些發(fā)現(xiàn)表明脂毒性肝細(xì)胞釋放的EV在NAFLD進展中起到促炎和纖維化的作用。

2.3 EV與NAFLD之纖維化

EV不僅具有促炎特性，它在肝臟纖維化中也起著作用。肝臟由肝細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、庫普弗細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、膽管細(xì)胞、HSC組成[21]。肝臟中的纖維化途徑主要受HSC調(diào)節(jié)，其產(chǎn)生并由纖維化介質(zhì)如結(jié)締組織生長因子調(diào)控。Charrier等[22]的實驗證明，活化的HSC包裹的EV中存在一種多功能肝素結(jié)合糖蛋白，即促纖維化結(jié)締組織因子(CCN2)，可穿梭至其他靜止或活化的HSC，肝臟在受到損傷時，以旁分泌的形式激活促纖維化作用。與此研究一致，Huang等[23]的研究發(fā)現(xiàn)，CCN2分子能夠聯(lián)合其他分子如纖連蛋白和轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)，促進活化的HSC增殖、存活、遷移、黏附和產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)，從而促進肝纖維化途徑。Koeck等[24]的研究也發(fā)現(xiàn)，內(nèi)臟脂肪組織中的EV可通過誘導(dǎo)肝細(xì)胞和HSC中TGF-β途徑的異常來參與NAFLD的進展。這些研究結(jié)果均表明，EV可能在NAFLD的纖維化過程中扮演了重要角色。

2.4 EV內(nèi)容物與NAFLD的診療前景

EV中攜帶的物質(zhì)在NAFLD的發(fā)生、發(fā)展和診斷中起著作用。Povero等[25]的體外實驗研究顯示，使用膽堿缺乏型L-氨基酸(CDAA)和高脂飲食構(gòu)建NAFLD小鼠模型，相比于對照組，NAFLD組血液循環(huán)中的EV數(shù)量增加，且蛋白質(zhì)組學(xué)分析揭示了NAFLD組與對照組之間EV蛋白組分的差別。NAFLD組血液循環(huán)中EV攜帶的miR-122水平顯著升高，并證明了NAFLD中的miR-122主要封裝在EV中，提示在NAFLD進展中肝細(xì)胞特異性miRNA通過血液循環(huán)中EV釋放。肝臟是miR-122的主要來源[26]。此外，Csak等[27]發(fā)現(xiàn)血液循環(huán)中EV的miR-122水平升高伴隨著肝臟中miR-122水平降低，肝臟中下降的miR-122水平有利于組織重構(gòu)調(diào)節(jié)劑上調(diào)，且在NASH的肝臟纖維化中扮演著重要的角色。Yamada等[28]采用NAFLD的大鼠模型觀測了血液循環(huán)中miR-122的水平，發(fā)現(xiàn)血清miR-122水平確實可用于評估早期NAFLD，并可能優(yōu)于傳統(tǒng)的臨床檢測肝臟情況的標(biāo)志物。這些動物研究為了解EV在NAFLD中的作用奠定了基礎(chǔ)。

Kornek等[29]首次在人類受試者中建立了免疫細(xì)胞衍生的EV的豐度與疾病嚴(yán)重程度、肝臟氨基轉(zhuǎn)移酶的水平、活組織檢查分級和NAFLD活動評分之間的相關(guān)性，也就是說可以用來自血清的免疫細(xì)胞微粒的量化來評估慢性肝病患者的肝臟炎性反應(yīng)程度和特征。該研究指出，慢性丙型肝炎(CHC)患者的血液循環(huán)中CD4+CD8+T細(xì)胞來源的微粒數(shù)量明顯增加，而NAFLD患者血液循環(huán)中來源于自然殺傷T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的微粒明顯增加。另一項轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析通過檢測EV中的miRNA，可區(qū)分NAFLD和CHC，且揭示了可通過miRNA來區(qū)分肝臟疾病的分級和階段[30]。

綜上所述，EV參與了NAFLD發(fā)病機制中的關(guān)鍵部分，如炎性反應(yīng)、血管生成、肝纖維化，并且其在NAFLD的診斷和治療中的作用也很重要。

3 小結(jié)與展望

EV在NAFLD的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。在疾病診斷方面，作為納米級生物膜結(jié)構(gòu)，EV可以很好地確保內(nèi)容物和生物活性的完整性，其具有作為NAFLD生物標(biāo)志物的巨大潛力。在治療應(yīng)用方面，EV因其穩(wěn)定性和生物安全性可作為遺傳物質(zhì)或藥物遞送的載體，基于改變EV分泌的策略可能有助于NAFLD的治療。此外，來源于間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的EV可能在一些肝臟疾病的治療中形成新的療法。但由于EV在生理條件下的重要作用，需要更多的研究來全面了解EV在NAFLD的生理和病理中的作用以及其在NAFLD診斷和治療中的作用。